雄の犬と猫の避妊薬の卵胞刺激ホルモン受容体の細胞外ドメインを標的とする抗体断片

去勢後の負のフィードバックの欠如に起因するLHレベルの増加は、長期的な健康問題に関連しています。LH経路を干渉することなく機能する代替避妊薬の必要性が存在します。この研究の目的は、ファージディスプレイ技術を使用して、卵胞刺激ホルモン受容体（抗FSHR）に対する抗体断片を開発し、セルトリ細胞機能への影響を評価することを目的としています。抗体フラグメントファゲミッドライブラリーから選択された犬および猫FSHRの細胞外ドメインに対するファージクローンは、表面プラズモン共鳴による結合速度論について分析されました。セルトリ細胞は、成体動物（5匹の犬と5匹の猫）の精巣から分離されました。有効性テストは、3回治療と比較して、抗FSHR抗体フラグメントでセルトリ細胞培養（SCC）を治療することにより実施されました。SCCにおけるアンドロゲン結合タンパク質（ABP）、インチビンサブユニットベータB（IHBB）および血管内皮成長因子A（VEGFA）mRNAの発現は、RT-QPCRによって定量化されました。結果は、精製犬と猫の抗FSHR抗体断片の分子量がそれぞれ25 kDaと15 kDaであることを示しました。したがって、タンパク質分子量に基づいて、犬と猫の抗体断片は、それぞれいわゆる単鎖可変フラグメント（SCFV）とナノボディ（NB）でした。解離定数（kd）との結合親和性は、犬と猫の抗FSHR抗体フラグメントでそれぞれ2.32×10-7 mおよび2.83×10-9 mでした。犬の抗FSHR SCFVとFSHRのCAT ECDの間の交差結合速度論的相互作用は、結合動力学を決定するために曲線に適合できませんでした。ただし、CAT抗FSHR NBと犬ECD FSHRの間の交差結合親和性KDは1.75×10-4 Mでした。抗FSHR抗体断片で処理した12.26、4.07および5.11倍）および猫（それぞれ39.53、14.07および20.29倍）は、セルトリ細胞機能が抑制されたことを示しています。結論として、この研究は、犬と猫のSCCのFSHRに対する種特異的抗体断片の確立を実証しました。フラグメントタンパク質は、コンパニオンアニマルのFSHRを標的とする非外科的避妊薬として開発される可能性を示しています。

The increased LH levels resulting from the absence of negative feedback after castration has been linked to long-term health issues. A need exists for an alternative contraceptive agent that functions without interfering the LH pathways. This study aimed to develop antibody fragments against the follicular-stimulating hormone receptor (anti-FSHr) using phage-display technology and evaluate its effects on Sertoli cell functions. Phage clones against the extracellular domain of dog and cat FSHr selected from an antibody fragment phagemid library were analyzed for binding kinetics by surface plasmon resonance. Sertoli cells were isolated from testes of adult animals (five dogs and five cats). Efficacy test was performed by treating Sertoli cell cultures (SCCs) with anti-FSHr antibody fragments compared with untreated in triplicates. Expressions of androgen binding protein (ABP), inhibin subunit beta B (IHBB) and vascular endothelial growth factor A (VEGFA) mRNA in SCCs were quantified by RT-qPCR. The results demonstrated that the molecular weight of the purified dog and cat anti-FSHr antibody fragment was 25 kDa and 15 kDa, respectively. Based on protein molecular weight, the antibody fragment of dogs and cats was therefore, so-called single-chain variable fragments (scFv) and nanobody (nb), respectively. The binding affinity with dissociation constant (KD) was 2.32 × 10-7 M and 2.83 × 10-9 M for dog and cat anti-FSHr antibody fragments, respectively. The cross-binding kinetic interactions between the dog anti-FSHr scFv and the cat ECD of FSHr could not be fitted to the curves to determine the binding kinetics. However, the cross-binding affinity KD between the cat anti-FSHr nb and the dog ECD FSHr was 1.75 × 10-4 M. The mRNA expression of ABP, IHBB and VEGFA in SCCs was less (P < 0.05) in both dogs (12.26, 4.07 and 5.11 folds, respectively) and cats (39.53, 14.07 and 20.29 folds, respectively) treated with anti-FSHr antibody fragments, indicating the Sertoli cell functions were suppressed. In conclusion, this study demonstrated the establishment of species-specific antibody fragments against FSHr in SCCs for dogs and cats. The fragment proteins illustrate potential to be developed as non-surgical contraceptive agent targeting FSHr in companion animals.