細胞毒性壊死因子（CNF）毒素における階層決定因子Rho Gタンパク質の分離とトランスグルタミン化を駆動する毒素

AB型細菌タンパク質毒素の細胞毒性壊死因子（CNF）ファミリーは、Rho GTPase基質の2種類の修飾、つまり脱アミド化とトランスグルタミネーションを触媒します。大腸菌CNF1とその密接なホモログタンパク質は主に脱アミド化を触媒し、ボルデテラ皮膚療法毒素（DNT）が主にトランスグルタミン化触媒であることが確立されています。急速に拡大する微生物ゲノムシーケンスデータは、CNF1ホモログの少なくとも13のフルレングスバリアントがあることを明らかにしています。大腸菌株GN02091のCNFXは、タンパク質レベルで50％-55％配列同一性を持つCNFファミリーの他のすべてのメンバーと、DNAレベルでサイトごとに0.45-0.52ヌクレオチド置換から最も遠い。CNFXはRhoA、RAC1、およびCDC42を修正し、CNF1と同様に、ヒトHEK293T細胞の下流のSRE依存性マイトジェンシグナル伝達経路を活性化しますが、1,000倍高いEC50値です。以前に特徴付けられた他のCNF毒素とは異なり、CNFXは、ゲルシフトアッセイによって証明され、大腸菌BL21細胞のRhoタンパク質基質と共発現した場合、またはHEK293T細胞の直接治療を通じてMALDI質量スペクトル分析によって確認されたように、主にトランスグルタミネーションによってRhoタンパク質を修飾します。。CNF1とCNFX配列の比較により、CNF1の位置832および862に対応する2つの臨界アクティブサイト残基が特定されました。各毒素のこれらの残基での相互部位特異的変異は、CNFSのトランスグルタミナーゼ活性に対するディアミダーゼとトランスグルタミナーゼ活性を定義する階層的なルールを明らかにしました。CNFXのC末端にある追加のユニークなCYS残基は、貨物の配達を遅らせるために重要であることが発見されました。輸込み毒性毒性壊死因子（CNF）毒素は、病原性大腸菌および他の細菌性病原体に重要な病原性の役割を果たしているだけでなく、CNF様の役割を果たします。遺伝子は、臨床分離株からの数のゲノムでも発見されています。CNF毒素間の進化的関係の力を活用することで、分離またはトランスグルタミネーションを介してRho GTPase基質を変更するかどうかを定義する階層的なアクティブサイト決定因子の解読が可能になりました。他の既知のCNFとは異なり、遠いCNFバリアント（CNFX）が主にそのrho gtPase基質をトランスグルタミネートするという私たちの発見により、「CNFS deAmidateおよびdnts transglutaminate」のパラダイムは、最終的に、以前の活性部位以外の活性部位内の活性部位内の2つの重要なアミノ酸残基に起因する可能性があります。特定された触媒Cys-hisダイアド残基。私たちのアプローチと研究結果の重要性は、精密治療戦略の開発における他の細菌タンパク質の酵素反応決定因子と基質特異性を解読することに適用できることです。

The cytotoxic necrotizing factor (CNF) family of AB-type bacterial protein toxins catalyze two types of modification on their Rho GTPase substrates: deamidation and transglutamination. It has been established that E. coli CNF1 and its close homolog proteins catalyze primarily deamidation and Bordetella dermonecrotic toxin (DNT) catalyzes primarily transglutamination. The rapidly expanding microbial genome sequencing data have revealed that there are at least 13 full-length variants of CNF1 homologs. CNFx from E. coli strain GN02091 is the most distant from all other members of the CNF family with 50%-55% sequence identity at the protein level and 0.45-0.52 nucleotide substitutions per site at the DNA level. CNFx modifies RhoA, Rac1, and Cdc42, and like CNF1, activates downstream SRE-dependent mitogenic signaling pathways in human HEK293T cells, but at a 1,000-fold higher EC50 value. Unlike other previously characterized CNF toxins, CNFx modifies Rho proteins primarily through transglutamination, as evidenced by gel-shift assay and confirmed by MALDI mass spectral analysis, when coexpressed with Rho-protein substrates in E. coli BL21 cells or through direct treatment of HEK293T cells. A comparison of CNF1 and CNFx sequences identified two critical active-site residues corresponding to positions 832 and 862 in CNF1. Reciprocal site-specific mutations at these residues in each toxin revealed hierarchical rules that define the preference for deamidase versus a transglutaminase activity in CNFs. An additional unique Cys residue at the C-terminus of CNFx was also discovered to be critical for retarding cargo delivery.IMPORTANCECytotoxic necrotizing factor (CNF) toxins not only play important virulence roles in pathogenic E. coli and other bacterial pathogens, but CNF-like genes have also been found in an expanding number of genomes from clinical isolates. Harnessing the power of evolutionary relationships among the CNF toxins enabled the deciphering of the hierarchical active-site determinants that define whether they modify their Rho GTPase substrates through deamidation or transglutamination. With our finding that a distant CNF variant (CNFx) unlike other known CNFs predominantly transglutaminates its Rho GTPase substrates, the paradigm of "CNFs deamidate and DNTs transglutaminate" could finally be attributed to two critical amino acid residues within the active site other than the previously identified catalytic Cys-His dyad residues. The significance of our approach and research findings is that they can be applied to deciphering enzyme reaction determinants and substrate specificities for other bacterial proteins in the development of precision therapeutic strategies.