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転写因子（TFS）は、転写抑制因子または活性化因子機能を持つ可能性のある関連する共調節因子とともに、ホモまたはヘテロ型DNA結合複合体を形成します。したがって、複合体の特定の組成を定義することは、それらの生物学的役割を理解するための鍵です。ここでは、二分子蛍光補完（BIFC）を利用して、活性化因子タンパク質-1（AP-1）および筋細胞エンハンサー因子2（MEF2）ファミリーに由来する定義されたTF二量体と関連する共レギュレーターの形成を視覚化しました。第一に、分割された蛍光タンパク質の無料組み合わせでタグ付けされたTFSを共発現する細胞でBIFCシグナルが観察され、定義された二量体複合体の操作された形成を実証しました。次に、このアプローチを適用し、個別のサブ核位置に局在する定義されたAP-1ダイマーが定義されていると判断しました。その後、GFP結合ペプチド（GBP）-NANOTRAPと組み合わせたBIFCの組み合わせにより、共調節因子、HDAC4、および定義されたBIFC-MEF2エンジニアリングダイマー間のタンパク質間相互作用の観察が可能になりました。細胞系における定義されたTFダイマーのトランス活性化特性を決定するために、GAL4/UASルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイシステムを使用して、GAL4-DNA結合ドメインをGBPに融合したGAL4-DNA結合ドメインを利用してBIFC-TF二量体の転写特性を評価しました。ここでは、定義されたTF二量体のエンジニアリング、視覚化、および機能分析を可能にするBIFC/GBP-Nanobodyアプローチの有効性を報告します。
転写因子（TFS）は、転写抑制因子または活性化因子機能を持つ可能性のある関連する共調節因子とともに、ホモまたはヘテロ型DNA結合複合体を形成します。したがって、複合体の特定の組成を定義することは、それらの生物学的役割を理解するための鍵です。ここでは、二分子蛍光補完（BIFC）を利用して、活性化因子タンパク質-1（AP-1）および筋細胞エンハンサー因子2（MEF2）ファミリーに由来する定義されたTF二量体と関連する共レギュレーターの形成を視覚化しました。第一に、分割された蛍光タンパク質の無料組み合わせでタグ付けされたTFSを共発現する細胞でBIFCシグナルが観察され、定義された二量体複合体の操作された形成を実証しました。次に、このアプローチを適用し、個別のサブ核位置に局在する定義されたAP-1ダイマーが定義されていると判断しました。その後、GFP結合ペプチド（GBP）-NANOTRAPと組み合わせたBIFCの組み合わせにより、共調節因子、HDAC4、および定義されたBIFC-MEF2エンジニアリングダイマー間のタンパク質間相互作用の観察が可能になりました。細胞系における定義されたTFダイマーのトランス活性化特性を決定するために、GAL4/UASルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイシステムを使用して、GAL4-DNA結合ドメインをGBPに融合したGAL4-DNA結合ドメインを利用してBIFC-TF二量体の転写特性を評価しました。ここでは、定義されたTF二量体のエンジニアリング、視覚化、および機能分析を可能にするBIFC/GBP-Nanobodyアプローチの有効性を報告します。
Transcription factors (TFs) form homo- or hetero-dimeric DNA binding complexes along with associated co-regulators that can have transcriptional repressor or activator functions. Defining the specific composition of the complexes is therefore key to understanding their biological role. Here, we utilized bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to visualize the formation of defined TF dimers and associated co-regulators derived from the activator protein-1 (AP-1) and myocyte enhancer factor 2 (MEF2) families. Firstly, BiFC signals were observed in cells co-expressing TFs tagged with complimentary combinations of the split fluorescent protein, demonstrating the engineered formation of defined dimer complexes. Next, we applied this approach and determined that defined AP-1 dimers localized at discrete sub-nuclear locations. Subsequently, a combination of BiFC coupled with GFP binding peptide (GBP)-nanotrap allowed observation of protein-protein interactions between a co-regulator, HDAC4, and defined BiFC-MEF2 engineered dimers. To determine transactivation properties of defined TF dimers in a cellular system, the Gal4-DNA binding domain fused to GBP was utilized to assess the transcriptional properties of the BiFC-TF dimers using a generically applicable Gal4/UAS luciferase reporter gene assay system. Here, we report efficacy of a BiFC/GBP-nanobody approach that allows engineering, visualization, and functional analysis of defined TF dimers.
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