胸水からの細胞外小胞の最適な分離とそのマイクロRNA貨物のプロファイリング

胸水は、良性と悪性の両方の胸膜疾患の両方で起こります。悪性胸水では、胸膜液細胞診の診断精度と感度は、特に悪性胸膜中皮腫の診断については完全ではありませんが、場合によっては肺、乳房、または他の乳房の転移性胸膜悪性腫瘍の診断の場合もあります。サイト。細胞外小胞（EV）は、胸膜疾患状態で選択的にパッケージ化され、差次的に発現されるマイクロRNA（miRNA）の濃縮貨物を運びます。胸膜液細胞外小胞（PFEV）におけるmiRNA貨物の診断可能性を調査するために、細胞外小胞（EV）画分を分離する方法を評価しました。PFEVは、総およびEV関連タンパク質、ナノ粒子追跡分析、および透過型電子顕微鏡による視覚化によって特徴付けられました。miRNA発現は、超微細ろ過（3 kDaフィルターユニット）による追加のRNA精製の有無にかかわらず、胸膜液から分離された別々のEV画分でNanostringNCounter®によって分析されました。最適なPFEV収量、純度、およびmiRNA発現は、PFEVが超遠心分離とSEC技術を組み合わせて処理された大量の胸水から分離されたときに観察されました。限外ろ過による総RNAの精製により、PFEV miRNAの検出可能性がさらに向上しました。この研究は、PFEVを分離する可能性と、ナノストリング技術を使用して病気のバイオマーカーを発見するPFEV miRNA貨物を調べる可能性を示しています。

Pleural effusion occurs in both benign and malignant pleural disease. In malignant pleural effusions, the diagnostic accuracy and sensitivity of pleural fluid cytology is less than perfect, particularly for the diagnosis of malignant pleural mesothelioma, but also in some cases for the diagnosis of metastatic pleural malignancy with primary cancer in the lung, breast or other sites. Extracellular vesicles (EVs) carry an enriched cargo of microRNAs (miRNAs) which are selectively packaged and differentially expressed in pleural disease states. To investigate the diagnostic potential of miRNA cargo in pleural fluid extracellular vesicles (PFEVs), we evaluated methods for isolating the extracellular vesicle (EV) fraction including combinations of ultracentrifugation, size-exclusion chromatography (SEC) and ultrafiltration (10 kDa filter unit). PFEVs were characterized by total and EV-associated protein, nanoparticle tracking analysis and visualisation by transmission electron microscopy. miRNA expression was analyzed by Nanostring nCounter® in separate EV fractions isolated from pleural fluid with or without additional RNA purification by ultrafiltration (3 kDa filter unit). Optimal PFEV yield, purity and miRNA expression were observed when PFEV were isolated from a larger volume of pleural fluid processed through combined ultracentrifugation and SEC techniques. Purification of total RNA by ultrafiltration further enhanced the detectability of PFEV miRNAs. This study demonstrates the feasibility of isolating PFEVs, and the potential to examine PFEV miRNA cargo using Nanostring technology to discover disease biomarkers.