分割インテイン媒介バックボーン環化は、強力なフィブリン選択プラスミノーゲン活性化因子であるスタフィロキナーゼの安定性と活性を高めます

黄色ブドウ球菌の特定の株によって分泌される小さな15kDA球状タンパク質であるスタフィロキナーゼ（SAK）は、強力なフィブリン選択的血栓溶解活性を示します。以前の研究では、SAKが現在使用されている血栓症活性化因子（TPA）などの血栓溶解剤の低コストの代替品になる可能性があることが示されています。臨床応用の可能性を改善する試みでは、SAKの多数の修正がすでに調査されています。ここでは、スプリットインインタイン媒介タンパク質骨格環化を介して調製された、新しいSAK修正、サイクル化サック（CYC-SAK）を特徴づけました。生物物理学的技術、限られたタンパク質分解研究、プラスミノーゲン（PG）活性化アッセイを使用して、CYC-SAKの構造、安定性、および活性を特徴付けました。我々の結果は、CYC-SAKが同一の構造、安定性の向上、エキソプロテアーゼによるタンパク質分解に対する耐性、およびその線形対応物と比較してPG活性化特性の改善を持っていることを示しています。大腸菌の細胞質の高収量で過剰発現することができ、2段階のプロセスで簡単に精製されます。インテイン媒介環化は、タンパク質発現中にin vivoで自然に発生し、タンパク質の精製後にさらに修飾ステップを必要としません。さらに、共有結合SAK環化は、以前に提案された他のSAK修飾と容易に組み合わせることができ、免疫原性が低く、安定性と活動が改善された効果的な血栓溶解剤を生成できます。

Staphylokinase (Sak), a small 15 kDa globular protein that is secreted by certain strains of Staphylococcus aureus, shows a potent fibrin-selective thrombolytic activity. Earlier work has shown that Sak could potentially become a low-cost alternative to currently used thrombolytic agents, such as tissue plasminogen activator (tPA). In attempts to improve its potential for clinical applications, numerous modifications of Sak have already been investigated. Here, we have characterized a novel Sak modification, cyclized Sak (cyc-Sak), which was prepared through split-intein mediated protein backbone cyclization. We have characterized the structure, stability and the activity of cyc-Sak using biophysical techniques, limited proteolysis studies and plasminogen (PG)-activation assays. Our results show that cyc-Sak possesses an identical structure, enhanced stability, resistance to proteolysis by exoproteases and improved PG-activation properties compared to its linear counterpart. It can be over-expressed with high yield in the cytoplasm of Escherichia coli and is easily purified in a two-step process. The intein-mediated cyclization occurs spontaneously in vivo during protein expression and does not necessitate further modification steps after purification of the protein. Furthermore, covalent Sak cyclization could be readily combined with other Sak modifications previously proposed, to generate an effective thrombolytic agent with lower immunogenicity and improved stability and activity.