デュアルRNAシーケンスにおける細菌mRNA濃縮戦略が改善され、植物菌相互作用のダイナミクスを明らかにする

背景：デュアルRNAシーケンスは、植物ミクローブの相互作用の根底にある分子ダイナミクスを包括的に理解できる強力なツールです。RNAシーケンス（RNA-seq）は、豊富なリボソームRNA（RRNA）の存在により、特に細菌性トランシクリプトームの転写分析に技術的なハードルをもたらします。したがって、細菌トランスクリプトームの費用対効果の高い包括的なシーケンスを実現するには、RRNAを排除し、細菌mRNAの割合を強化するための効率的な方法を考案することが不可欠です。この研究では、細菌に感染した植物サンプルの細菌mRNAの割合を濃縮することを目的として、鎖固有の二重RNA-Seq法を修正しました。濃縮された方法には、細菌mRNA濃縮の選択とrRNA除去による植物mRNAの連続的な分離と、それに続く鎖固有のRNA-seqライブラリの準備ステップが含まれます。病原性細菌との宿主耐性と非宿主耐性の両方の相互作用を含むさまざまな植物菌相互作用を採用し、コショウとトマトを使用した有益な根圏関連細菌との相互作用を使用することにより、従来の方法と比較して、濃縮法の効率を評価しました。それぞれ植物。 結果：調べた植物菌相互作用のすべての場合において、より低い読み取りカウントを生成しましたが、濃縮方法でマッピング効率の増加が観察されました。特に、Xanthmonas campestris pvとの互換性のある相互作用において。Vesicatoria Race 3（XCV3）、濃縮法は、XCV3感染コショウサンプルの独自のゲノム（15.09％; 1.45倍の増加）とCDS（8.92％; 1.49倍の増加）とのマッピング比を強化しました。濃縮法は、特にピーマンのXCV3感染の初期段階で、調査されたすべての倍率変化閾値レベルで、従来のRNA-seq法よりも多くの差次的に発現した遺伝子（deg）を一貫して表示しました。遺伝子オントロジー（GO）濃縮分析により、DEGは主にタンパク質分解、キナーゼ、セリン型エンドペプチダーゼ、ヘム結合活性に濃縮されていることが明らかになりました。 結論：この研究で実証された濃縮法は、細菌mRNAを濃縮し、植物菌相互作用内の複雑なトランスクリプトームの変化に関する新しい洞察を提供する既存のRNA-seqメソッドの適切な代替手段として機能します。

BACKGROUND: Dual RNA sequencing is a powerful tool that enables a comprehensive understanding of the molecular dynamics underlying plant-microbe interactions. RNA sequencing (RNA-seq) poses technical hurdles in the transcriptional analysis of plant-bacterial interactions, especially in bacterial transcriptomics, owing to the presence of abundant ribosomal RNA (rRNA), which potentially limits the coverage of essential transcripts. Therefore, to achieve cost-effective and comprehensive sequencing of the bacterial transcriptome, it is imperative to devise efficient methods for eliminating rRNA and enhancing the proportion of bacterial mRNA. In this study, we modified a strand-specific dual RNA-seq method with the goal of enriching the proportion of bacterial mRNA in the bacteria-infected plant samples. The enriched method involved the sequential separation of plant mRNA by poly A selection and rRNA removal for bacterial mRNA enrichment followed by strand specific RNA-seq library preparation steps. We assessed the efficiency of the enriched method in comparison to the conventional method by employing various plant-bacterial interactions, including both host and non-host resistance interactions with pathogenic bacteria, as well as an interaction with a beneficial rhizosphere associated bacteria using pepper and tomato plants respectively. RESULTS: In all cases of plant-bacterial interactions examined, an increase in mapping efficiency was observed with the enriched method although it produced a lower read count. Especially in the compatible interaction with Xanthmonas campestris pv. Vesicatoria race 3 (Xcv3), the enriched method enhanced the mapping ratio of Xcv3-infected pepper samples to its own genome (15.09%; 1.45-fold increase) and the CDS (8.92%; 1.49-fold increase). The enriched method consistently displayed a greater number of differentially expressed genes (DEGs) than the conventional RNA-seq method at all fold change threshold levels investigated, notably during the early stages of Xcv3 infection in peppers. The Gene Ontology (GO) enrichment analysis revealed that the DEGs were predominantly enriched in proteolysis, kinase, serine type endopeptidase and heme binding activities. CONCLUSION: The enriched method demonstrated in this study will serve as a suitable alternative to the existing RNA-seq method to enrich bacterial mRNA and provide novel insights into the intricate transcriptomic alterations within the plant-bacterial interplay.