ニューロンと血管のさまざまなマーカーの分析のための高速クリアリングと高解像度染色

背景：組織の除去により、組織の透明度を高めることにより、さまざまな組織の深い画像診断が可能になりますが、脳全体などの大型組織の免疫染色の制限がありました。 方法：ここでは、高速クリアリングと高解像度染色（HCH）と呼ばれる新しいクリアリング技術を使用して、マウス全体の脳全体組織を排除および免疫染色しました。共焦点顕微鏡と光シート蛍光顕微鏡（LSFM）の両方を使用して、透明な脳内の神経構造を観察しました。再構築された3D画像は、計算再構成アルゴリズムを使用して分析されました。 結果：GAD-Green蛍光タンパク質（GFP）マウスからの透明な脳の3次元（3D）画像では、さまざまな神経構造がよく観察されました。両方のトランスジェニックマウスの固有の蛍光シグナルは、HCHS後に保存されました。さらに、軽度の洗剤ベースの溶液を使用してHCHS法によって免疫染色された脳の大規模な3Dイメージングにより、C-FOS、ニューロン核タンパク質（NEUN）、微小管などのいくつかのニューロンマーカーのグローバルなトポロジカル分析が可能になりました。- 関連タンパク質2（MAP2）、TUJ1、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）、およびチロシンヒドロキシラーゼ（TH）は、マウス脳全体組織全体のさまざまな解剖学的領域にあります。最後に、キュービック、ヴァイシコール、3discoなどのさまざまな既存の組織除去方法論との比較により、HCHSの方法論により、組織の変形が比較的少なく、蛍光保持が高いことが確認されました。 結論：結論として、新しい組織 - クリアリング技術（HCHS）に基づく3Dイメージングの開発により、脳内に存在する神経および血管ネットワークの詳細な空間分析が可能になります。

BACKGROUND: Tissue clearing enables deep imaging in various tissues by increasing the transparency of tissues, but there were limitations of immunostaining of the large-volume tissues such as the whole brain. METHODS: Here, we cleared and immune-stained whole mouse brain tissues using a novel clearing technique termed high-speed clearing and high-resolution staining (HCHS). We observed neural structures within the cleared brains using both a confocal microscope and a light-sheet fluorescence microscope (LSFM). The reconstructed 3D images were analyzed using a computational reconstruction algorithm. RESULTS: Various neural structures were well observed in three-dimensional (3D) images of the cleared brains from Gad-green fluorescent protein (GFP) mice and Thy 1-yellow fluorescent protein (YFP) mice. The intrinsic fluorescence signals of both transgenic mice were preserved after HCHS. In addition, large-scale 3D imaging of brains, immune-stained by the HCHS method using a mild detergent-based solution, allowed for the global topological analysis of several neuronal markers such as c-Fos, neuronal nuclear protein (NeuN), Microtubule-associated protein 2 (Map2), Tuj1, glial fibrillary acidic protein (GFAP), and tyrosine hydroxylase (TH) in various anatomical regions in the whole mouse brain tissues. Finally, through comparisons with various existing tissue clearing methodologies such as CUBIC, Visikol, and 3DISCO, it was confirmed that the HCHS methodology results in relatively less tissue deformation and higher fluorescence retention. CONCLUSION: In conclusion, the development of 3D imaging based on novel tissue-clearing techniques (HCHS) will enable detailed spatial analysis of neural and vascular networks present within the brain.