T7 RNAポリメラーゼとそのCヘリックス変異体によるDNA末端依存性転写

メッセンジャーRNA（mRNA）ベースのワクチンの顕著な成功は、ワクチン開発と治療タンパク質送達のための新しいバイオテクノロジープラットフォームとしての可能性を強調しています。しかし、in vitro転写に広く使用されているバクテリオファージT7の単一サブユニットRNAポリメラーゼは、哺乳類の自然免疫応答を強く刺激する二本鎖RNA（DSRNA）副産物を生成することがよく知られています。DSRNAは、セルフテンプレートRNA伸長またはプロモーターに依存しない転写から発生したと報告されています。ここでは、in vitro転写中の全長dsRNAの主要な供給源は、T7 RNAポリメラーゼによるDNA末端開始転写であることを確認しました。DNAテンプレートの最後のグアノシンまたはシトシンは、DNA末端開始転写を促進します。さらに、Cヘリックスの位置47に位置する芳香族残基が、完全長dsRNAの生成を大幅に減少させることがわかりました。その結果、T7 RNAポリメラーゼG47W変異体を使用して合成されたmRNAは、野生型T7 RNAポリメラーゼを使用して生成されたmRNAと比較して、より高い発現効率と低い免疫原性を示します。

The remarkable success of messenger RNA (mRNA)-based vaccines has underscored their potential as a novel biotechnology platform for vaccine development and therapeutic protein delivery. However, the single-subunit RNA polymerase from bacteriophage T7 widely used for in vitro transcription is well known to generate double-stranded RNA (dsRNA) by-products that strongly stimulate the mammalian innate immune response. The dsRNA was reported to be originated from self-templated RNA extension or promoter-independent transcription. Here, we identified that the primary source of the full-length dsRNA during in vitro transcription is the DNA-terminus-initiated transcription by T7 RNA polymerase. Guanosines or cytosines at the end of DNA templates enhance the DNA-terminus-initiated transcription. Moreover, we found that aromatic residues located at position 47 in the C-helix lead to a significant reduction in the production of full-length dsRNA. As a result, the mRNA synthesized using the T7 RNA polymerase G47W mutant exhibits higher expression efficiency and lower immunogenicity compared to the mRNA produced using the wild-type T7 RNA polymerase.