複製の起源を最適化することによるM13ファージ滴定の強化

背景と目的：修正されたM13ファージバリアントであるM13KO7は、P15A複製起点とTN903カナマイシン耐性遺伝子を運びます。この研究の目的は、P15A起源を高コピーPMB1起源（500-700コピー数）に置き換えることにより、M13KO7の複製を最適化することを目的としています。 実験的アプローチ：P15A複製起源とカナマイシン耐性遺伝子を欠くM13KO7プラスミドからの6431-ヌクレオチド断片を、長いポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して増幅しました。修飾されたM13AMB1プラスミドは、このフラグメントの3 '端にアデニンを添加し、T/Aクローニングを使用してPMB1含有フラグメントに結合することにより作成されました。その後、ファージを調製するために、PM13AMB1は大腸菌TG1細菌に変換され、その後、PEG-NaCl沈殿を使用して、修正ファージが伝播されました。修正されたファージ力価は、M13KO7ファージと比較して、シリアル希釈とQPCRメソッドを利用して決定されました。 調査結果/結果：結果は、シリアル希釈法では、修正ファージとM13KO7ファージの力価がそれぞれ4.8×1014および7×1012 PFU/mLであることを示しました。さらに、修飾ファージのQPCR法で計算されたファージ力価は1.3×109 PFU/mLに等しく、M13KO7ファージでは4.08×108 PFU/mLでした。 結論と意味：この研究は、複製起点置換がファージ力価の大幅な増加をもたらしたという証拠を提供します。分子生物学用途の複製最適化の重要性を強調しています。

BACKGROUND AND PURPOSE: M13KO7, a modified M13 phage variant, carries the p15A replication origin and Tn903 kanamycin resistance gene. This study aimed to optimize M13KO7's replication by substituting the p15A origin with the higher-copy pMB1 origin (500-700 copy numbers). EXPERIMENTAL APPROACH: A 6431-nucleotide fragment from the M13KO7 plasmid lacking the p15A replication origin and kanamycin resistance gene was amplified using a long polymerase chain reaction (PCR). The modified M13AMB1 plasmid was created by adding adenine to the 3' ends of this fragment and ligating it to the pMB1-containing fragment using T/A cloning. Afterward, to prepare the phage, pM13AMB1 was transformed into E. coli TG1 bacteria, and then, using the PEG-NaCl precipitation, the modified phage was propagated. The modified phage titer was determined utilizing the serial dilution and the qPCR methods, compared with the M13KO7 phage. FINDINGS/RESULTS: The results showed that in the serial dilution method, the titers of modified phage and M13KO7 phage were 4.8 × 1014 and 7 × 1012 pfu/mL, respectively. Besides, the phage titer calculated by the qPCR method for the modified phage was equal to 1.3 × 109 pfu/mL, whereas it was 4.08 × 108 pfu/mL for the M13KO7 phage. CONCLUSION AND IMPLICATIONS: This study provides evidence that replication origin replacement led to a significant increase in phage titers. It highlights the importance of replication optimization for molecular biology applications.