ディウラフィスの侵入に対する小麦細胞壁防御メカニズムのβ-1,3-グルカナーゼとペルオキシダーゼ物理化学的特性の解明

ロシアの小麦アブラムシ（RWA）に侵入された小麦植物は、β-1,3-グルカナーゼやペリオキシダーゼ（POD）など、過敏症に関連する反応（HR）や病因関連（PR）タンパク質の誘導を含む防御反応のカスケードを誘導します。この研究の目的は、細胞壁関連PODおよびβ-1,3-グルカナーゼの物理化学的特性を特徴付け、RWASA2-Wheatの相互作用中の細胞壁修飾に関する相乗効果を決定することです。感受性のあるチュゲラ、適度に耐性のあるトゥゲラDN1、および耐性のトゥゲラDN5品種を前処理し、温室条件下で植え、植え付け後14日後に受精し、3日ごとに灌漑しました。植物には、3葉の段階で同じRWASA2クローンの20人の副腎形成個体が感染し、浸透後1〜14日で葉を収穫しました。細胞間洗浄液（IWF）を真空ろ過を使用して抽出し、-20°Cで保存しました。葉の残留物を粉末に押しつぶし、細胞壁成分に使用しました。ポッドの活性と特性評価は、5 mMグアアコール基質とH2O2を使用して決定され、470 nmでの吸光度の変化を監視しました。β-1,3-グルカナーゼ活性、pH、および温度最適条件は、β-1,3-グルカンおよびβ-1,3-1,4-グルカン基質を使用して、DNS試薬を使用して加水分解物の総還元糖を測定することにより実証されました。、540 nmでの吸光度を測定し、グルコース標準曲線を使用します。pH最適は、pH 4から9、温度が25〜50°Cの間で、30°Cから70°Cの熱安定性の間で決定されました。β-1,3-グルカナーゼ基質の特異性は、25°Cおよび40°Cで、CurdlanおよびBorleyβ-1,3-1,4-グルカン基質を使用して決定しました。さらに、β-1,3-グルカナーゼの作用モードは、ラミナリビオスからラミナリパンテオースを使用して決定されました。オリゴ糖加水分解生成物パターンは、薄層クロマトグラフィ（TLC）で定性的に分析され、HPLCで定量的に分析されました。この研究で提示された方法は、小麦にRWAに侵入し、細胞壁領域からペルオキシダーゼとβ-1,3-グルカナーゼを抽出し、その包括的な生化学的特性を抽出するための堅牢なアプローチを示しています。

Wheat plants infested by Russian wheat aphids (RWA) induce a cascade of defense responses, including the hypersensitive responses (HR) and induction of pathogenesis-related (PR) proteins, such as β-1,3-glucanase and peroxidase (POD). This study aims to characterize the physicochemical properties of cell wall-associated POD and β-1,3-glucanase and determine their synergism on the cell wall modification during RWASA2-wheat interaction. The susceptible Tugela, moderately resistant Tugela-Dn1, and resistant Tugela-Dn5 cultivars were pregerminated and planted under greenhouse conditions, fertilized 14 days after planting, and irrigated every 3 days. The plants were infested with 20 parthenogenetic individuals of the same RWASA2 clone at the 3-leaf stage, and leaves were harvested at 1 to 14 days post-infestation. The Intercellular wash fluid (IWF) was extracted using vacuum filtration and stored at -20 °C. Leaf residues were crushed into powder and used for cell wall components. POD activity and characterization were determined using 5 mM guaiacol substrate and H2O2, monitoring change in absorbance at 470 nm. β-1,3-glucanase activity, pH, and temperature optimum conditions were demonstrated by measuring the total reducing sugars in the hydrolysate with DNS reagent using β-1,3-glucan and β-1,3-1,4-glucan substrates, measuring the absorbance at 540 nm, and using glucose standard curve. The pH optimum was determined between pH 4 to 9, temperature optimum between 25 and 50 °C, and thermal stability between 30 °C and 70 °C. β-1,3-glucanase substrate specificity was determined at 25 °C and 40 °C using curdlan and barley β-1,3-1,4-glucan substrates. Additionally, the β-1,3-glucanase mode of action was determined using laminaribiose to laminaripentaose. The oligosaccharide hydrolysis product patterns were qualitatively analyzed with thin-layer chromatography (TLC) and quantitatively analyzed with HPLC. The method presented in this study demonstrates a robust approach for infesting wheat with RWA, extracting peroxidase and β-1,3-glucanase from the cell wall region and their comprehensive biochemical characterization.