ヒト末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにおけるDNTP選択性の分子基盤の計算モデリング研究

ヒト末端のデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TDT）は、V（D）J組換えおよびDNAの非依存性結合を介したDNA修復中にテンプレートに依存しないDNA合成を触媒できます。一本鎖DNAへのヌクレオチドのテンプレート非依存性ランダム添加の能力により、このポリメラーゼは、修飾DNTPを使用したオリゴヌクレオチドの連続的な段階的合成を含むさまざまな分子生物学的応用で有用になります。それにもかかわらず、この酵素の応用に対する重大な制限は、DGTP>DTTP≈DATP> DCTPの順序でのDNTPに対するヒトTDTの強い選択性です。この研究には、DNTPに対する酵素の選択性に対するアミノ酸置換の潜在的な影響をシミュレートするための分子動力学が含まれていました。窒素塩基とアミノ酸残基との間に安定した水素結合の形成は、DNTPの好みにとって重要であることがわかった。これらの位置での一連の単一施設および二重施設変異体のセットは、分子動力学シミュレーションによって分析されました。データは、野生型酵素と比較してさまざまなDNTPに対して実質的に均等化された選択性を有する置換D395Nまたは置換D395NまたはD395N+E456Nのいずれかの2つのTDT変異体を含むことを明らかにしました。これらの結果は、バイオテクノロジーアプリケーションのDNTP選択性を均等化したTDT様酵素の合理的な設計を可能にします。

Human terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) can catalyze template-independent DNA synthesis during the V(D)J recombination and DNA repair through nonhomologous end joining. The capacity for template-independent random addition of nucleotides to single-stranded DNA makes this polymerase useful in various molecular biological applications involving sequential stepwise synthesis of oligonucleotides using modified dNTP. Nonetheless, a serious limitation to the applications of this enzyme is strong selectivity of human TdT toward dNTPs in the order dGTP > dTTP ≈ dATP > dCTP. This study involved molecular dynamics to simulate a potential impact of amino acid substitutions on the enzyme's selectivity toward dNTPs. It was found that the formation of stable hydrogen bonds between a nitrogenous base and amino acid residues at positions 395 and 456 is crucial for the preferences for dNTPs. A set of single-substitution and double-substitution mutants at these positions was analyzed by molecular dynamics simulations. The data revealed two TdT mutants-containing either substitution D395N or substitutions D395N+E456N-that possess substantially equalized selectivity toward various dNTPs as compared to the wild-type enzyme. These results will enable rational design of TdT-like enzymes with equalized dNTP selectivity for biotechnological applications.