大腸菌のLPP遺伝子における高プロモーター変異

大腸菌で最も豊富なタンパク質である主要な外膜リポタンパク質の遺伝子のプロモーターは、大腸菌で最も強力なプロモーターの1つであると考えられています。-10およびLPPプロモーターの-10および-35領域のヌクレオチド配列は、合成オリゴヌクレオチド指向部位特異的変異誘発によるそれぞれのコンセンサス配列に準拠するために段階的に変化しました。次に、変異したプロモーターをLACZ遺伝子に融合して、プロモーター活性を測定しました。-10領域（AATACT）がTatact（P1）とTataat（コンセンサスシーケンス; P2）に変更された場合、ベータガラクトシダーゼ活性は約1.9および2.4倍増加しました。同様に、-35領域（TTCTCA）がそれぞれTTCACA（R1）とTTGACA（コンセンサスシーケンス; R2）に変更された場合、それは約1.2と4.2倍増加しました。-10領域と-35領域での変異が組み合わされた場合、R2-P1のプロモーター活性の全体的な改善は、野生型プロモーターのそれよりも4.0倍になりましたが、R2-P2の場合はわずか2.5倍でした。これらの結果は、2つの重要な領域のいずれかをそれぞれのコンセンサスシーケンスに変更することで、プロモーター活性の大幅な改善を達成できることを示しています。ただし、両方の地域でのコンセンサスシーケンスへの完全な適合性は、必ずしも最高のアクティビティをもたらすわけではありません。発現クローンビヒクルPIN-III-ompaで改善されたLPPプロモーターを使用して、ブドウ球菌ヌクレアーゼAは、総細胞タンパク質の約47％のレベルで産生されました。

The promoter of the gene for the major outer membrane lipoprotein, the most abundant protein in Escherichia coli, is considered to be one of the strongest promoters in E. coli. The nucleotide sequences of the -10 and the -35 regions of the lpp promoter were altered in a step-wise manner to conform to their respective consensus sequences by synthetic oligonucleotide-directed site-specific mutagenesis. The mutated promoters were then fused to the lacZ gene to measure promoter activity. The beta-galactosidase activity increased approximately 1.9 and 2.4 fold when the -10 region (AATACT) was altered to TATACT(P1) and TATAAT (consensus sequence; P2), respectively. Similarly, it increased approximately 1.2 and 4.2 fold, when the -35 region (TTCTCA) was altered to TTCACA(R1) and TTGACA (consensus sequence; R2), respectively. When the mutations at the -10 and -35 regions were combined, the overall improvement of the promoter activity for R2-P1 was 4.0 fold over that of the wild-type promoter, while it was only 2.5 fold for R2-P2. These results indicate that substantial improvement of the promoter activity can be achieved by changing either of the two key regions to their respective consensus sequences. However, the complete conformity to consensus sequences at both regions does not necessarily result in the highest activity. With use of the improved lpp promoter in an expression cloning vehicle pIN-III-ompA, staphylococcal nuclease A was produced at a level of approximately 47% of the total cellular protein.