膜タンパク質の二量体化を調査するための細胞外両分子蛍光補完：クラスB GPCRを使用した概念実証

二分子蛍光補完（BIFC）方法論は、分割された蛍光タンパク質を使用して、生細胞のタンパク質間の相互作用を検出します。これまで、BIFCは、異なる受容体成分の細胞内部分の間に蛍光タンパク質を分割することにより、受容体の二量体化を調査するために使用されてきました。代わりに、これらの分割タンパク質を細胞外N末端に取り付けると、この方法論の柔軟性が向上し、障害のある細胞内シグナル伝達の可能性が低下する可能性があると推論しました。概念の実証として、我々は、カルシトニン遺伝子関連ペプチドに受容体を使用しました。これは、アクセサリータンパク質を持つ複合体のカルシトニンまたはカルシトニン受容体様受容体のいずれかのヘテロダイマーを含む（受容体活性化タンパク質1）。レプチングMvenusフラグメントが受容体サブユニットのC末端またはN末端のいずれかに付着した融合構築物を作成しました。得られたコンストラクトをCOS7およびHEK293S細胞にトランスフェクトし、リガンド刺激、受容体複合体の細胞表面発現、およびBIFC蛍光に応じてcAMP産生を測定しました。さらに、HEK293S細胞におけるリガンド依存性の内在化を調査しました。N末端の融合は、cAMPのシグナル伝達と受容体の内在化に関して、より忍容性が高いことがわかりました。N末端融合は、機能的蛍光Mvenusタンパク質の再構成も可能にしました。ただし、蛍光収率はC末端融合よりも低かった。我々の結果は、BIFCの方法論が受容体N末端に適用され、それによりこのアプローチの柔軟性を高め、受容体の二量体化に関するさらなる洞察を可能にすることを示唆しています。

Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) methodology uses split fluorescent proteins to detect interactions between proteins in living cells. To date, BiFC has been used to investigate receptor dimerization by splitting the fluorescent protein between the intracellular portions of different receptor components. We reasoned that attaching these split proteins to the extracellular N-terminus instead may improve the flexibility of this methodology and reduce the likelihood of impaired intracellular signal transduction. As a proof-of-concept, we used receptors for calcitonin gene-related peptide, which comprise heterodimers of either the calcitonin or calcitonin receptor-like receptor in complex with an accessory protein (receptor activity-modifying protein 1). We created fusion constructs in which split mVenus fragments were attached to either the C-termini or N-termini of receptor subunits. The resulting constructs were transfected into Cos7 and HEK293S cells, where we measured cAMP production in response to ligand stimulation, cell surface expression of receptor complexes, and BiFC fluorescence. Additionally, we investigated ligand-dependent internalization in HEK293S cells. We found N-terminal fusions were better tolerated with regards to cAMP signaling and receptor internalization. N-terminal fusions also allowed reconstitution of functional fluorescent mVenus proteins; however, fluorescence yields were lower than with C-terminal fusion. Our results suggest that BiFC methodologies can be applied to the receptor N-terminus, thereby increasing the flexibility of this approach, and enabling further insights into receptor dimerization.