シロイヌナズナがバスタから回復する能力と、Cas9を含まない変異体を分離する際のその応用

Agrobacteriumを介したCRISPR-CAS9ベースの植物での遺伝子編集を成功裏に実行した後、Cas9 T-DNAの分離は、誘導された変異の安定した継承に不可欠です。ここでは、Cas9を含まない変異体の分離を可能にする簡単な手法を報告し、露光または他の複雑な方法の必要性を排除します。この方法は、バスタに敏感なシロイヌナズナの苗木の能力に基づいています。これは、一般的に滅び、バスタフリーの成長媒体に移植されると回復して成長します。Basta選択媒体上の単一焦点挿入バスタ耐性植物の遺伝子編集されたヘテロ接合集団を成長させることにより、Cas9 T-DNAを欠く植物を特定できます。CAS9を欠くこれらの淡い植物は、CAS9を含まない植物を回収するためにバスタを欠く培地で救助されます。バスタセレクションから苗木が回復する能力は、カメリナ、キャノーラ、小麦でも研究されました。3つの作物はすべて異なる回復率を示し、小麦はバスタから正常な成長媒体に移植された後、最高の回復を示しました。要約すると、我々の調査結果は、バスタに敏感な苗の回復能力を活用することにより、Cas9 T-DNAを欠く植物を効果的に特定し、救助できることを示しており、シロイヌナズナのCas9を含まない変異体の分離を可能にし、他の作物に潜在的に拡張することを可能にします。

After successfully performing Agrobacterium-mediated CRISPR-Cas9-based gene editing in plants, isolation of the Cas9 T-DNA is essential for the stable inheritance of induced mutations. Here, we report a simple technique that allows the isolation of Cas9-free mutants, eliminating the need for outcrossing or other intricate methods. This method is based on the ability of Basta-sensitive Arabidopsis thaliana seedlings, which generally perish, to recover and grow once transplanted to Basta-free growth media. By growing gene-edited heterozygous populations of single-locus insertion Basta-resistant plants on Basta selection media, plants lacking the Cas9 T-DNA can be identified. These pale-looking plants lacking Cas9 are then rescued on media lacking the Basta to recover Cas9-free plants. The ability of seedlings to recover from Basta selection was also studied in camelina, canola, and wheat. All three crops showed different recovery rates, with wheat demonstrating the highest recovery once transplanted from Basta to normal growth media. In summary, our findings demonstrate that by harnessing the recovery capability of Basta-sensitive seedlings, we can effectively identify and rescue plants lacking the Cas9 T-DNA, enabling the isolation of Cas9-free mutants in Arabidopsis and potentially extending to other crops.