DHAおよびEPAエチルエステル加水分解に向けて選択的酵素のスクリーニングのための分光光度アッセイ

ドコサヘキサエン酸（DHA）やエイコサペンタエン酸（EPA）などの多価不飽和脂肪酸（PUFA）は、医薬品の関連性のために顕著な有意性を保持します。野菜、魚油、藻類などの多様なソースからPUFAを取得すると、混合脂肪酸（FA）組成のために課題があります。したがって、特定のFASに焦点を当てるには、精製と解像度のプロセスが必要です。これに対処するために、エチルEPA（E-EPA）またはエチルDHA（E-DHA）を選択するリパーゼをスクリーニングするための連続アッセイを提案します。マイクロプレート分光光度測定を利用して、この方法により、エチルエステル（E-EPAまたはE-DHA）からの解放された脂肪酸の定量化が可能になります。これには、各基質について個別に、または参照基質である酢酸酸化酸塩との競合で、p-ニトロフェノール酸プロトン化を介したFAの放出を測定することにより、酵素選択性を評価することが含まれます。10個のリパーゼがスクリーニングを受け、エチルDHA加水分解に対するバークホルディアセパシアリパーゼ（BCL）の好みが明らかになりました（E-EPA/E-DHA = 0.82±0.07およびE-EPA/E-DHA = 0.13±0.04のリパーゼ選択性比）E-EPAとE-DHAの両方に対するカンジダ南極リパーズB（CALB）の高い特異的活性（それぞれ531.14±37.76および281.79±2.79 U/mg）およびE-EPAの好み（E-EPA/E-DHA = 1.86±±±±±±0.15およびS E-EPA/E-DHA = 2.59±0.15）。Candida rugosa組換えアイソフォーム4（RCRLIP4）および市販のカンジダルゴサリパーゼ（CRL）は、E-EPA加水分解（EEPA/E-DHA = 2.18±0.51および2.26±0.36;およびS E-EPA/E-DHA = 7.59±1.59および7.88±2.13）。RCRLIP4、BCL、およびCALBのドッキング分析では、活性化エネルギーまたは触媒セリンへの距離に統計的に有意な差は示されませんでした。しかし、彼らは実験結果に同意しました。これらの発見は、CalBがE-EPA選択性を高めるための潜在的な突然変異誘発または指示された進化戦略を示唆しており、RCRLIP4はさらなる調査の有望な候補として浮上しています。このアッセイは、医薬品およびバイオテクノロジーの用途に幅広い意味を持つ、望ましい基質選択性を持つリパーゼを識別するための貴重なツールを提供します。

Polyunsaturated fatty acids (PUFAs), such as docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA), hold notable significance due to their pharmaceutical relevance. Obtaining PUFAs from diverse sources like vegetables, fish oils, and algae poses challenges due to the mixed fatty acid (FA) composition. Therefore, focusing on particular FAs necessitates purification and resolution processes. To address this, we propose a continuous assay for screening lipases selective for ethyl EPA (E-EPA) or ethyl DHA (E-DHA). Utilizing microplate spectrophotometry, the method enables quantification of liberated fatty acids from ethyl esters (E-EPA or E-DHA). This involves assessing enzyme selectivity by measuring the release of FAs through p-nitrophenolate protonation, either separately for each substrate or in competition with a reference substrate, resorufin acetate. Ten lipases underwent screening, revealing Burkholderia cepacia lipase's (BCL) preference for ethyl DHA hydrolysis (E-EPA/E-DHA = 0.82 ± 0.07 and the lipase selectivity ratio (S) for E-EPA/E-DHA = 0.13 ± 0.04) and Candida antarctica lipase B's (CALB) high specific activity towards both E-EPA and E-DHA (531.14 ± 37.76 and 281.79 ± 2.79 U/mg, respectively) and E-EPA preference (E-EPA/E-DHA = 1.86 ± 0.15 and S E-EPA/E-DHA = 2.59±0.15). Candida rugosa recombinant isoform 4 (rCRLip4) and commercial Candida rugosa lipase (CRL) exhibited significant preference for E-EPA hydrolysis (E-EPA/E-DHA = 2.18 ±0.51 and 2.26 ±0.36, respectively; and S E-EPA/E-DHA = 7.59 ± 1.59 and 7.88 ± 2.13, respectively). Docking analyses of rCRLip4, BCL, and CALB demonstrated no statistically significant differences in activation energies or distances to the catalytic serine; however, they agreed with the experimental results. These findings suggest potential mutagenesis or directed evolution strategies for CALB to enhance E-EPA selectivity, with rCRLip4 emerging as a promising candidate for further investigation. This assay offers a valuable tool for identifying lipases with desired substrate selectivity, with broad implications for pharmaceutical and biotechnological applications.