高い安定性と生産性を持つ先祖の哺乳類アルカリホスファターゼの設計

非標識：哺乳類のアルカリホスファターゼ（AP）は、診断と分子生物学で広く使用されていますが、大腸菌で発現することが困難で熱安定性が低いため、その広範な使用は損なわれます。これらの課題を克服するために、シーケンスベースのタンパク質再設計方法、特に完全なコンセンサス設計（FCD）および祖先シーケンス再構成（ASR）を採用して、プロパティを強化したAPを作成しました。生化学的分析により、これらの新しく設計されたAPは、酵素活性を妨げることなく、牛の腸APアイソザイムII（BIAPII）と比較して、活性形態での発現レベルが改善され、熱安定性が増加したことが明らかになりました。特に、設計されたAPの培養スープの活動は、BiAPIIの培養スープの活性よりも数桁高く、それらの熱安定性は13°C-17°C（T50として測定）増加しました。また、熱安定性と発現レベルに影響を与える領域を特定するために、BiAPIIの28の単一点変異体を評価しました。これらの突然変異は、設計されたAPSでは一般的でしたが、BiAPIIでは一般的でした。T413EやG402などの特定の変異は熱安定性を高めましたが、発現レベルを上げると複数の変異が必要でした。これは、発現レベルを高めるために相乗効果が必要であることを示唆しています。熱安定性を高める変異はクラウンドメインにありましたが、発現を改善するものは二量体界面に近く、これらの強化を支える明確なメカニズムを示しています。 重要性：フルコンセンサス設計（FCD）や祖先シーケンス再構成（ASR）などのシーケンスベースのタンパク質再設計方法は、急速に拡大するシーケンスデータベースに登録されたタンパク質配列データを利用して新しい酵素を構築する可能性があります。これらの酵素の熱安定性は、診断と分子生物学の応用を拡大します。これらの酵素は、大腸菌による高レベルの活性発現も実証しています。これらの特性により、これらのAPは産業用アプリケーションの魅力的な候補になります。さらに、さまざまなアミノ酸残基が主に熱安定性と活性発現の原因であり、FCDおよびASRによる酵素を設計するための戦略に重要な意味を示唆しています。

UNLABELLED: Mammalian alkaline phosphatase (AP) is widely used in diagnostics and molecular biology but its widespread use is impaired because it is difficult to express in Escherichia coli and has low thermostability. To overcome these challenges, we employed sequence-based protein redesign methods, specifically full consensus design (FCD) and ancestral sequence reconstruction (ASR), to create APs with enhanced properties. Biochemical analyses revealed that these newly designed APs exhibited improved levels of expression in their active form and increased thermostability compared to bovine intestinal AP isozyme II (bIAPII), without impeding enzymatic activity. Notably, the activity in culture broth of the designed APs was an order of magnitude higher than that of bIAPII, and their thermal stability increased by 13°C-17°C (measured as T50). We also assessed 28 single-point mutants of bIAPII to identify regions influencing thermostability and expression level; these mutations were common in the engineered APs but not in bIAPII. Specific mutations, such as T413E and G402S, enhanced thermostability, whereas increasing the expression level required multiple mutations. This suggests that a synergistic effect is required to enhance the expression level. Mutations enhancing thermostability were located in the crown domain, while those improving expression were close to the dimer interface, indicating distinct mechanisms underpinning these enhancements. IMPORTANCE: Sequence-based protein redesign methods, such as full consensus design (FCD) and ancestral sequence reconstruction (ASR), have the potential to construct new enzymes utilizing protein sequence data registered in a rapidly expanding sequence database. The high thermostability of these enzymes would expand their application in diagnostics and molecular biology. These enzymes have also demonstrated a high level of active expression by Escherichia coli. These characteristics make these APs attractive candidates for industrial application. In addition, different amino acid residues are primarily responsible for thermal stability and active expression, suggesting important implications for strategies for designing enzymes by FCD and ASR.