Streptavidinベースの生体溶剤干渉法とのDNAタンパク質相互作用の分析

タンパク質-DNA相互作用は、必須の細胞プロセスを支えています。これらの相互作用を理解することは、さまざまな経路の分子メカニズムを解明するために重要です。DNA分子の構造、配列、長さなどの重要な要因は、タンパク質結合に大きな影響を与える可能性があります。生体層干渉法（BLI）は、分子間の結合速度論を測定するラベルフリーの手法であり、タンパク質DNA相互作用を定量的に研究するための簡単で正確なアプローチを提供します。従来のゲルベースの方法よりもBLIの主な利点は、結合動態に関するリアルタイムデータを提供し、動的タンパク質DNA相互作用の平衡解離定数（KD）の正確な測定を可能にすることです。この記事では、DNA複製タンパク質、複製タンパク質A（RPA）、および一本鎖DNA（SSDNA）基質との間の相互作用のKD値を決定するための基本的なプロトコルを紹介します。RPAはSSDNAを高い親和性で結合しますが、生物学的経路内でのその後のタンパク質相互作用を促進するためにも簡単に変位する必要があります。記載されているBLIアッセイでは、ビオチン化SSDNAをストレプトアビジンでコーティングしたバイオセンサーに固定化されています。次に、RPAのバイオセンサー結合DNAへの結合速度（関連性と解離）を測定します。結果のデータを分析して、システムソフトウェアを使用して、アソシエーションレート定数（KA）、解離速度定数（KD）、および平衡結合定数（KD）の正確な値を導出します。

Protein-DNA interactions underpin essential cellular processes. Understanding these interactions is critical for elucidating the molecular mechanisms of various pathways. Key factors such as the structure, sequence, and length of a DNA molecule can significantly influence protein binding. Bio-layer interferometry (BLI) is a label-free technique that measures binding kinetics between molecules, offering a straightforward and precise approach to quantitatively study protein-DNA interactions. A major advantage of BLI over traditional gel-based methods is its ability to provide real-time data on binding kinetics, enabling accurate measurement of the equilibrium dissociation constant (KD) for dynamic protein-DNA interactions. This article presents a basic protocol for determining the KD value of the interaction between a DNA replication protein, replication protein A (RPA), and a single-stranded DNA (ssDNA) substrate. RPA binds ssDNA with high affinity but must also be easily displaced to facilitate subsequent protein interactions within biological pathways. In the described BLI assay, biotinylated ssDNA is immobilized on a streptavidin-coated biosensor. The binding kinetics (association and dissociation) of RPA to the biosensor-bound DNA are then measured. The resulting data are analyzed to derive precise values for the association rate constant (ka), dissociation rate constant (kd), and equilibrium binding constant (KD) using system software.