アデノウイルスDNA複製の起源：in vivoでの最小限のDNA配列要件

ヘルパーとして非欠損アデノウイルスを供給すると、2つのクローン化された逆アデノウイルス末端を含むアデノウイルスミニ染色体がin vivoで複製されます。このシステムは、in vivoでのアデノウイルスDNA複製に必要な最小CIS作用DNA配列を定義するために使用されています。アデノウイルス逆末端反復（ITR）の両端への削除は、BAL31エキソヌクレアーゼと、細菌のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子によって分離された削除されたITRの2つの反転コピーを含むプラスミドに構築された結果の分子で生成されました。切断されたアデノウイルス末端を露出するように切断されたin vivoプラスミドの欠失の効果を決定するために、アデノウイルス2型DNAと組織培養細胞に同時トランスフェクトしました。アデノウイルス末端を持つ分子の複製能力は、メチル化されていないしたがって非複数の入力DNAのみを切断する制限酵素であるDPNIで処理された抽出されたDNAの南ブロットによってアッセイされました。ウイルスゲノムの末端45 bpを含む分子は完全に活性でしたが、このアッセイでは36 bpのみを含む分子は活動していませんでした。したがって、DNA複製に必要な配列は、ウイルスゲノムの端子45 bp内に完全に含まれています。したがって、前述の高度に保存された領域（ヌクレオチド9-18）と細胞核因子Iの結合部位（ヌクレオチド19-48）の両方が、in vivoでのアデノウイルスDNA複製に不可欠です。

Adenovirus mini-chromosomes which contain two cloned, inverted adenovirus termini replicate in vivo when supplied with non-defective adenovirus as a helper. This system has been used to define the minimum cis acting DNA sequences required for adenovirus DNA replication in vivo. Deletions into each end of the adenovirus inverted terminal repeat (ITR) were generated with Bal31 exonuclease and the resulting molecules constructed into plasmids which contained two inverted copies of the deleted ITR separated by the bacterial neomycin phosphotransferase gene. To determine the effect of the deletion in vivo plasmids cleaved to expose the adenovirus termini were co-transfected with adenovirus type 2 DNA into tissue culture cells. The replicative ability of the molecules bearing adenovirus termini was assayed by Southern blotting of extracted DNA which had been treated with DpnI, a restriction enzyme which cleaves only methylated and therefore unreplicated, input DNA. Molecules containing the terminal 45 bp of the viral genome were fully active whereas molecules containing only 36 bp were in-active in this assay. Therefore sequences required for DNA replication are contained entirely within the terminal 45 bp of the viral genome. Thus, both the previously described highly conserved region (nucleotides 9-18) and the binding site for the cellular nuclear factor I (nucleotides 19-48) are essential for adenovirus DNA replication in vivo.