制限エンドヌクレアーゼECORI触媒反応の立体化学コース

制限エンドヌクレアーゼECORIは、デオキシグアノシンとデオキシグアノシンの間の切断部位にキラルなリン酸化部位に含まれるD（PGGSAATCCC）の類似体であるD（PGGSAATCCC）のRPジアステレオマーを加水分解します（Deoxyadenosine Residues（connolly、beb.v.v.v.v.v.v.v.v.v.、pingoud、A.、およびGrotjahn、L。（1984）生化学23、3343-3453）。H2（18）oで反応を実行すると、5 '末端に18o含有のホスホロチオエート基を持つヘキサヌクレオチドD（[18o、s] Paattcc）につながります。ヌクレアーゼp1によるこのヘキサマーのさらなる加水分解により、デオキシアデノシン5'-O- [18O]リンチオエートが生成されます。これは、アデニル酸キナーゼとピルビン酸キナーゼでステレオスペシでリン酸化することができます。31p NMR分光法は、この化合物の酸素-18がアルファとベータリン原子の間の架橋位置にあることを示しています。したがって、ecoriによって触媒される加水分解反応は、リンでの構成の反転によって進行します。この結果は、共有結合酵素中間体の関与なしに、リンでのH2Oの直接的な酵素触媒結核攻撃と互換性があります。

The restriction endonuclease EcoRI hydrolyzes the Rp diastereomer of d(pGGsAATTCC), an analogue of d(pGGAATTCC) containing a chiral phosphorothioate group at the cleavage site between the deoxyguanosine and the deoxyadenosine residues (Connolly, B.A., Potter, B.V.L., Eckstein, F., Pingoud, A., and Grotjahn, L. (1984) Biochemistry 23, 3343-3453). Performing the reaction in H2(18)O leads to d(pGG) and the hexanucleotide d([18O, S]pAATTCC) which has an 18O-containing phosphorothioate group at the 5' terminus. Further hydrolysis of this hexamer with nuclease P1 yields deoxyadenosine 5'-O-[18O]phosphorothioate which can be stereospecifically phosphorylated with adenylate kinase and pyruvate kinase to give Sp-[18O] deoxyadenosine 5'-O-(1-thiotriphosphate). 31P NMR spectroscopy shows the oxygen-18 in this compound to be in a bridging position between the alpha- and beta-phosphorus atoms. Thus, the hydrolysis reaction catalyzed by EcoRI proceeds with inversion of configuration at phosphorus. This result is compatible with a direct enzyme-catalyzed nucleophilic attack of H2O at phosphorus without involvement of a covalent enzyme intermediate.