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活性ゲル手順は、ヒトポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼの機能的ポリペプチドを特定するために説明されています。HeLa細胞からの精製または粗酵素調製物は、GAPP DNAを含むドデシル硫酸 - ポリアクリルアミドゲルで電気泳動しました。in situでペプチドの再生後、無傷のゲルを[32p] NADを含むポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ反応混合物でインキュベートしました。ゲルのオートラジオグラムは、MR = 116,000-120,000で一貫して主要なアクティビティバンドを示しました。多くのランで、MR = 125,000、135,000、および145,000の3つのマイナーなバンドが見られました。[32p] NADは、酵素阻害剤3-アミノベンズアミドをゲルインキュベーション混合物に加えた場合、活動バンドが検出できなかったため、次のようにポリ（ADPリボース）に組み込まれているように見えました。（ii）バンドから電気溶出された放射性ポリマーは、ホスホジエステラーゼIによって完全に消化されました。異なるDNA損傷剤で処理されたHeLa細胞の抽出物の予備活性ゲル分析により、MR = 116,000の見かけの活性が約増加することが明らかになりました。10ミクロムマトマイシンCで処理した細胞で1 mMジメチル酸ジメチル酸ジメチルで処理した細胞で10倍は、1 mMメチルメタンスルホン酸メチルで処理された細胞でわずかな増加のみが得られ、活性帯域パターンの変化はありませんでした。UV照射の50および100 j/m-2の後に観察されました。
活性ゲル手順は、ヒトポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼの機能的ポリペプチドを特定するために説明されています。HeLa細胞からの精製または粗酵素調製物は、GAPP DNAを含むドデシル硫酸 - ポリアクリルアミドゲルで電気泳動しました。in situでペプチドの再生後、無傷のゲルを[32p] NADを含むポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ反応混合物でインキュベートしました。ゲルのオートラジオグラムは、MR = 116,000-120,000で一貫して主要なアクティビティバンドを示しました。多くのランで、MR = 125,000、135,000、および145,000の3つのマイナーなバンドが見られました。[32p] NADは、酵素阻害剤3-アミノベンズアミドをゲルインキュベーション混合物に加えた場合、活動バンドが検出できなかったため、次のようにポリ（ADPリボース）に組み込まれているように見えました。（ii）バンドから電気溶出された放射性ポリマーは、ホスホジエステラーゼIによって完全に消化されました。異なるDNA損傷剤で処理されたHeLa細胞の抽出物の予備活性ゲル分析により、MR = 116,000の見かけの活性が約増加することが明らかになりました。10ミクロムマトマイシンCで処理した細胞で1 mMジメチル酸ジメチル酸ジメチルで処理した細胞で10倍は、1 mMメチルメタンスルホン酸メチルで処理された細胞でわずかな増加のみが得られ、活性帯域パターンの変化はありませんでした。UV照射の50および100 j/m-2の後に観察されました。
An activity gel procedure is described to identify functional polypeptides of human poly(ADP-ribose) polymerase. Purified or crude enzyme preparations from HeLa cells were electrophoresed in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels containing gapped DNA. After renaturation of the peptides in situ, the intact gel was incubated in a poly(ADP-ribose) polymerase reaction mixture containing [32P]NAD. Autoradiograms of the gels consistently exhibited a major activity band at Mr = 116,000-120,000; in many runs, three minor distinct bands at Mr = 125,000, 135,000, and 145,000 were also seen. [32P]NAD appeared to be incorporated into poly(ADP-ribose) since: (i) the activity bands were not detectable when the enzyme-inhibitor 3-aminobenzamide was added to the gel incubation mixture; and (ii) the radioactive polymer, electroeluted from the bands, was completely digested by phosphodiesterase I. Preliminary activity gel analysis of extracts of HeLa cells treated with different DNA-damaging agents revealed that the apparent activity of the Mr = 116,000 form increased by about 10-fold in cells treated with 1 mM dimethyl sulfate and 10-20-fold in cells treated with 10 microM mitomycin C. Only a small increase was obtained in cells treated with 1 mM methyl methanesulfonate, and no change in the activity band pattern was observed after 50 and 100 J/m-2 of UV irradiation.
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