DNase Iの作用様式に対する二重陽イオンの効果I

DNase IによるDNAの加水分解に対する異なる二価金属イオンの効果は、酵素とDNAの間の初期出会い中のDNA基質の片方または両方の鎖の切断を区別するアッセイで研究されました。共有閉じた超肝SV40（I）DNAを基質として使用して、緩和された円または単位長さの線形で構成される初期反応生成物は、アガロースゲルの放射性標識DNAの電気泳動によって分解されます。Mn2+またはCo2+などの遷移金属イオンの存在下でのみ、特定の反応条件下でのみ、DNase Iは同じ点またはその近くで両方のDNA鎖を切断し、単位長さの線形を生成できます。両方のDNA鎖を切断するこの能力は、温度の低下、単独のイオンの添加または遷移金属イオンではない別の二価陽イオンの添加、またはDNA基質の超肝ターンの数の減少などによって阻害されます。これらの要因はすべて、二重ヘリックスの巻線につながり、遷移金属イオン結合によって促進された二重の巻き戻しに拮抗します。したがって、遷移金属イオンは、DNA基質を局所的に局所的に変換し、DNase Iが両方の鎖に破損を導入できる形に変換する場合があります。Mg2+の存在下で、DNase IはSV40（I）にシングルストランドニックを導入し、反応の初期産物として共有結合したリラックスした円形SV40（II）のみを生成します。Mn2+の存在下で、DNase Iは初期産物として、Duplexの同じ点またはその近くにある反対側の鎖の2つのニックによって形成されるSV40（II）と単位長SV40線形DNA分子の混合物を生成します。これらの円形SV40（II）分子は2つのタイプで構成されています。マイノリティクラスは、Mg2+の存在下でDNase Iによって生成されたニック付きSV40（II）と区別できません。多数派クラスは、2つの鎖の1つにギャップを含む分子で構成されており、ギャップの平均長は11ヌクレオチドです。MN2+の存在下で生成されたSV40（L）分子は、一方または両方の端に単一の鎖エクステンションを持っているように見えます。

The effect of different divalent metal ions on the hydrolysis of DNA by DNase I was studied with an assay which distinguishes between cleavage of one or both strands of the DNA substrate during initial encounters between enzyme and DNA. Using covalently closed superhelical SV40(I) DNA as substrate, initial reaction products consisting of relaxed circles or unit-length linears are resolved by electrophoresis of radioactively labeled DNA in agarose gels. Only in the presence of a transition metal ion, such as Mn2+ or Co2+, and only under certain reaction conditions, is DNase I able to cut both DNA strands at or near the same point, generating unit-length linears. This ability to cut both DNA strands is inhibited by such factors as temperature decrease, the addition of a monovalent ion or another divalent cation which is not a transition metal ion, or a reduction in the number of superhelical turns in the DNA substrate. All of these factors lead to a winding of the duplex helix and antagonize the unwinding of the duplex promoted by transition metal ion binding. Transition metal ions may thus convert the DNA substrate locally to a form in which DNase I can introduce breaks into both strands. In the presence of Mg2+, DNase I introduces single strand nicks into SV40(I), generating exclusively the covalently open, relaxed circular SV40(II) as the initial product of the reaction. In the presence of Mn2+, DNase I generates as initial products a mixture of SV40(II) and unit-length SV40 linear DNA molecules, formed by two nicks in opposite strands at or near the same point in the duplex. These circular SV40(II) molecules consist of two types. A minority class is indistinguishable from the nicked SV40(II) produced by DNase I in the presence of Mg2+. The majority class consists of molecules containing a gap in one of the two strands, the mean length of the gap being 11 nucleotides. The SV40(L) molecules produced in the presence of Mn2+ appear to have single strand extensions at one or both ends.