cAMP依存性プロテインキナーゼIの調節サブユニットにおけるジスルフィド間結合

ブタcAMP依存性プロテインキナーゼからの精製調節サブユニットの2つのプロトマーIは、インターチェーンジスルフィド結合によって共有結合されていることが示されています。ポリペプチド鎖を2つの断片に切断する限られたタンパク質分解は、ジスルフィド結合がポリペプチド鎖のNH2末端領域に対応する断片とのみ関連していることを示した。このNH2末端フラグメントは、分子の約15〜20％を占めました。ジスルフィド結合は、ネイティブの調節サブユニットのシステインをアルキル化することによってさらに特徴付けられました。性能酸による酸化後、各調節サブユニットには7つのシステイン酸残基が含まれていました。ただし、変性条件下では、事前の減少がなければ、ヨード酢酸でアルキル化できるシステイン残基は5つだけです。限られたタンパク質分解後、これらの5つのシステインはすべて、より大きなCOOH末端のcAMP結合ドメインと関連していました。対照的に、変性サブユニットがアルキル化の前に最初に減少した場合、7つのシステイン残基すべてがアルキル化されました。事前の還元後にアルキル化にのみアクセスできる2つのシステインは、最終的に5,400ペプチドを使用して、ポリペプチド鎖のNH2末端末端と関連していました。ヨード酢酸による分離された変性NH2末端ドメインのアルキル化は、断片が最初にジチオトレイトールで還元されない限り、共有結合修飾をもたらしませんでした。NH2末端およびCOOH末端ドメインは、プロリンとアルギンの両方が豊富なポリペプチド鎖の領域によってリンクされることが示されました。タンパク質分解切断に容易に傾向があるのは、アルギニンが豊富な部位です。

The two protomers of the purified regulatory subunit from porcine cAMP-dependent protein kinase I have been shown to be covalently cross-linked by interchain disulfide bonding. Limited proteolysis which cleaves the polypeptide chain into two fragments demonstrated that the disulfide bonding was associated exclusively with the fragment that corresponded to the NH2-terminal region of the polypeptide chain. This NH2-terminal fragment accounted for approximately 15 to 20% of the molecule. The disulfide bonding was further characterized by alkylating the cysteines in the native regulatory subunit. Following oxidation with performic acid, each regulatory subunit contained 7 cysteic acid residues; however, under denaturing conditions, but without prior reduction, only 5 cysteine residues could be alkylated with iodoacetic acid. Following limited proteolysis, all five of these cysteines were associated with the larger COOH-terminal, cAMP binding domain. In contrast, if the denatured subunit was first reduced prior to alkylation, all 7 cysteine residues were alkylated. The 2 cysteines that were only accessible to alkylation after prior reduction were both associated with the NH2-terminal end of the polypeptide chain ultimately with a 5,400 peptide. Alkylation of the isolated, denatured NH2-terminal domain with iodoacetic acid resulted in no covalent modification unless the fragment was first reduced with dithiothreitol. The NH2-terminal and COOH-terminal domains were shown to be linked by a region of the polypeptide chain that is rich in both proline and arginine. It is the arginine-rich site that is readily prone to proteolytic cleavage.