エンケファリンコンバーターゼの精製と特性評価、エンケファリンシンセ化カルボキシペプチダーゼ

副腎髄質クロマフィン顆粒に存在するエンケファリン合成カルボキシペプチダーゼであるエンケファリンコンバーターゼも、脳および下垂体で検出されています。これら3つのカルボキシペプチダーゼ活性が同じ酵素を表すかどうかを判断するために、副腎髄質、脳全体、および下垂体全体からエンケファリンコンバーターゼを精製および特徴づけました。3つの組織すべての酵素は、DEAEセルロース、ゲルろ過、コンカナバリンA、およびL-アルギニンアフィニティカラムに共重量化され、135,000倍、110,000倍、およびウシ副腎髄質、脳、および2,800倍精製されます。それぞれ下垂体。精製エンケファリンコンバーターゼは、ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動に均一であるように見え、3つの組織すべてから分離された酵素について、見かけの分子量が50,000の単一帯域を示します。副腎、脳、下垂体エンケファリンコンバーターゼは、ヘキサペプチドエンケファリン前駆体および活性部位指向阻害剤によって同様に阻害されます。両方の[Met] - および[Leu] Enkephalin-Arg6は、50〜80 microMのKi値でエンケファリンコンバーターゼを阻害し、[Met]および[Leu] Enkephalin-Lys6は3倍低いです。2つの活性部位指向阻害剤、グアニジノプロピルスッシン酸とグアニジノエチルメルカプトスッ酸は、KI値が8-9 nmの3つの酵素すべての強力な阻害剤です。一連のダンシル化Di-、Tri-、およびテトラペプチド基質は、3つの酵素で同様の速度論的特性（km、Vmax、およびkcat/km）を持つエンケファリンコンバーターゼによって加水分解されます。この証拠は、エンケファリンコンバーターゼ活性が副腎髄質、脳、下垂体の同じ酵素を表していることを示唆しています。エンケファリンコンバーターゼは、エンケファリン以外の他のペプチド神経伝達物質とホルモンの産生に関与している可能性があります。

Enkephalin convertase, an enkephalin-synthesizing carboxypeptidase present in adrenal medulla chromaffin granules, has also been detected in brain and pituitary. To determine whether these three carboxypeptidase activities represent the same enzyme, we purified and characterized enkephalin convertase from adrenal medulla, whole brain, and whole pituitary. Enzyme from all three tissues co-purifies on DEAE-cellulose, gel filtration, concanavalin A, and L-arginine affinity columns, resulting in a 135,000-fold, 110,000-fold, and 2,800-fold purification for bovine adrenal medulla, brain, and pituitary, respectively. Purified enkephalin convertase appears homogeneous on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, showing a single band with an apparent molecular weight of 50,000 for enzyme isolated from all three tissues. Adrenal, brain, and pituitary enkephalin convertase are similarly inhibited by hexapeptide enkephalin precursors and active site-directed inhibitors. Both [Met]-and [Leu]enkephalin-Arg6 inhibit enkephalin convertase with Ki values between 50 and 80 microM, while [Met]-and [Leu]enkephalin-Lys6 are 3-fold less potent. Two active site-directed inhibitors, guanidinopropylsuccinic acid and guanidinoethylmercaptosuccinic acid, are potent inhibitors of all three enzymes with Ki values of 8-9 nM. A series of dansylated di-, tri-, and tetrapeptide substrates are hydrolyzed by enkephalin convertase with similar kinetic properties (Km, Vmax, and Kcat/Km) for the three enzymes. This evidence suggests that enkephalin convertase activity represents the same enzyme in adrenal medulla, brain, and pituitary. Enkephalin convertase may be involved in the production of other peptide neurotransmitters and hormones besides enkephalin.