ウニの卵の受精膜を硬化させる酵素であるオボペルオキシダーゼの精製と特性

ウニの卵、stringylocentrotus purpuratusの卵からのオボペルオキシダーゼは、明らかな均一性に精製されています。オボペルオキシダーゼは、受精時に卵から分泌され、in vivoで、タンパク質チロシル残基間の架橋を形成することにより、受精膜の硬化を担当します。精製は、酢酸による皮質顆粒エキソサイトーシスの活性化、次にNH4SO4沈殿、二価カチオンの非存在下でのDEAE-セファセルクロマトグラフィー、およびCMセファデックスクロマトグラフィーが行われました。精製された酵素は、ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動に基づいた、MR 70,000の糖タンパク質です。酵素は、ヘムペルオキシダーゼに典型的なUV可視スペクトルを示します（Epsilon 412 = 1.19 x 10（5）m-1 cm-1）。オボペルオキシダーゼは、塩化物ではなく、チロシン、グアアコール、ヨウ化物、臭化物の酸化を触媒し、H2O2または8％の相対効率で酸化基質として過酸化エチルを使用できます。フェニルヒドラジン、3-アミノ-1,2,4-トリアゾール、アジド、および亜硫酸塩はすべて、in vivoで硬化を阻害する濃度と同様の濃度で精製オボペルオキシダーゼを阻害します。3-アミノ-1,2,4-トリアゾールによる阻害は可逆的であり、H2O2が必要であり、基質の代謝回転と比較して遅いです。精製された酵素は、ネイティブ状態のプロテアーゼ切断に敏感であり、MRの活性産物が約50,000の産物を生成し、使用されたプロテアーゼによってわずかに変化します。オボペルオキシダーゼは、高分子アセンブリと修飾のパラダイムとしての受精膜形成の研究に有用なツールを提供する必要があります。

The ovoperoxidase from the egg of the sea urchin, Strongylocentrotus purpuratus, has been purified to apparent homogeneity. Ovoperoxidase is secreted from the egg at fertilization and is responsible, in vivo, for hardening of the fertilization membrane by forming cross-links between protein tyrosyl residues. Purification was accomplished by activation of cortical granule exocytosis with acetic acid, followed by NH4SO4 precipitation, DEAE-Sephacel chromatography in the absence of divalent cations, and CM-Sephadex chromatography. The purified enzyme is a glycoprotein of Mr 70,000, based on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The enzyme exhibits a UV-visible spectrum typical of heme peroxidases (epsilon 412 = 1.19 X 10(5) M-1 cm-1). Ovoperoxidase catalyzes the oxidation of tyrosine, guaiacol, iodide, and bromide, but not chloride, and can employ either H2O2 or, with 8% relative efficiency, ethyl peroxide as an oxidative substrate. Phenylhydrazine, 3-amino-1,2,4-triazole, azide, and sulfite all inhibit purified ovoperoxidase at concentrations similar to those that inhibit hardening in vivo. Inhibition by 3-amino-1,2,4-triazole is reversible, requires H2O2, and is slow relative to substrate turnover. The purified enzyme is sensitive to protease cleavage in the native state, yielding an active product of Mr approximately 50,000 which varies slightly depending upon the protease employed. Ovoperoxidase should provide a useful tool for the study of fertilization membrane formation as a paradigm of macromolecular assembly and modification.