ウシ枝鎖アルファケト酸デヒドロゲナーゼのジヒドロリポイルトランスアシラーゼ成分の触媒および構造特性

分岐鎖α-ケト酸デヒドロゲナーゼは、3つの触媒成分、すなわち分岐鎖酸性酸デカルボキシラーゼ（E1）、ジヒドリポイルトランスアシラーゼ（E2）、およびジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ（E3）で構成される多酵素複合体です。このレポートでは、ウシ腎臓と肝臓からの高度に精製された分岐鎖アルファケト酸デヒドロゲナーゼのE2成分は、この成分の独立した放射能アッセイで特徴付けられました。アッセイは、モデル反応を使用します：R-14CO-S-COA + LIP-（SH）2平衡R-14CO-S-LIP-SH + COA-SH。この反応では、外因性ジヒドロリポアミドはタンパク質（E2）結合ジヒドリポイル部分を置き換え、[1-14C]アシルCoA合成は酵素的にアシルCoA基質です。反応生成物のチオエステル構造であるS-アシルディヒドリポアミドは、質量分析、232-245 nmでの特徴的な吸収、およびヒドロキシルアミンとのヒドロキサメートの形成によって同定されました。さまざまな[1-14C]アシルコアとのE2触媒トランスアシル化反応の速度は、[1-14C]イソババリエル-CoAをより大きい[1-14C]アセチル-COAよりも大きい[1-14C]イソブチリル-CoAの順にいます。アセチル-CoAを用いた活性は、イソ酸化リル-CoAの15％です。E2活性は、ヒ素によって強く阻害されます。N-エチルマレイミドの存在下での還元アシル化による共有結合したリポイル部分の修飾は、トランスアシル化反応に影響を与えません。これらのデータは、初期速度および製品阻害の結果とともに、モデル反応がランダムなBI BIメカニズムを介して進行することを示唆しています。精製されたウシ肝枝鎖アルファケト酸デヒドロゲナーゼをトリプシンとともに限定したタンパク質分解は、複合体によって触媒される全体的な活性を完全に喪失します。それにもかかわらず、E2成分の活動は影響を受けません。トリプティック消化は、E2サブユニット（MR = 52,600）をMR = 25,700の主要な断片に切断します。対照的に、複合体のE1アルファおよびE1ベータサブユニットは、トリプシンによるタンパク質分解に対して比較的耐性があります。結果は、分岐鎖アルファケト酸デヒドロゲナーゼのE2成分の構造特性が類似しているが、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のトランスセチラーゼ成分の構造と同一ではないことを示しています。

Branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase is a multienzyme complex consisting of three catalytic components, i.e. branched-chain alpha-keto acid decarboxylase (E1), dihydrolipoyl transacylase (E2), and dihydrolipoyl dehydrogenase (E3). In this report the E2 component of highly purified branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase from bovine kidney and liver was characterized with an independent radiochemical assay for this component. The assay uses the model reaction: R-14CO-S-CoA + Lip-(SH)2 in equilibrium R-14CO-S-Lip-SH + CoA-SH, which is similar to that catalyzed by the transacetylase component of the pyruvate dehydrogenase complex. In this reaction, exogenous dihydrolipoamide substitutes for the protein (E2)-bound dihydrolipoyl moiety, and [1-14C]acyl-CoA synthesized enzymatically is the acyl-CoA substrate. The thioester structure of the reaction product, S-acyldihydrolipoamide, was identified by mass spectrometry, its characteristic absorption at 232-245 nm and by formation of hydroxamate with hydroxylamine. Rates of the E2-catalyzed transacylation reaction with various [1-14C]acyl-CoAs are in the order of [1-14C]isobutyryl-CoA greater than [1-14C] isovaleryl-CoA greater than [1-14C]acetyl-CoA. The activity with acetyl-CoA is 15% of that with isobutyryl-CoA. The E2 activity is strongly inhibited by arsenite. Modification of the covalently bound lipoyl moiety through reductive acylation in the presence of N-ethylmaleimide is without effect on the transacylation reaction. These data, along with results of initial velocity and product inhibition suggest that the model reaction proceeds via a random Bi Bi mechanism. Limited proteolysis of purified bovine liver branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase with trypsin results in complete loss of the overall activity catalyzed by the complex. Nonetheless the activity of the E2 component is not affected. The tryptic digestion cleaves E2 subunits (Mr = 52,600) into a major fragment of Mr = 25,700. By contrast, E1 alpha and E1 beta subunits of the complex are relatively resistant to proteolysis with trypsin. The results indicate that structural properties of the E2 component of branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase are similar but not identical to those of the transacetylase component of the pyruvate dehydrogenase complex.