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反応を触媒するSaccharomyces cerevisiaeの酵素：L-ガラクトノラクトン + O2はL-アスコルビン酸 + H2O2につながり、酵母ホモジネートのミトコンドリア画分から466倍精製されました。酵素には、nishikimi et al。[アーチ。生化学。生物生物。191、479-486（1978）]。デオキシ酸ナトリウムの存在下でのゲルろ過により、活性酵素について見かけのMRが70 000を得た。デオキシコレートの存在下でのポリアクリルアミド勾配ゲル電気泳動は74 000のMRを与えましたが、ドデシルスルル酸ナトリウム/ポリアクリルアミドゲル電気泳動は18 000のMRに対応する1つのタンパク質バンドのみを示しました。基質特異性は、アルドノ酸ラクトンL-ガラクトノ、d-アルトロノ、L-フコノ、D-アラビノ-1,4ラクトンに限定されています。L-GulonoおよびD-Galactono-1,4ラクトンでは、競合阻害が実証されました。P-クロロメルコリフェニルスルホン酸、ヨードアセトアミド、N-エチルマレイミド、硫酸、および硫化物はすべて酵素に対して阻害されました。シアン化物、アジド、EDTA、アルファ、アルファビピリジル、またはディスルホン酸塩菌を加えた場合、効果は見られませんでした。基質としてL-ガラクトノラクトンを含む0.3 mmの見かけのkmが見つかりました。酸素のkmは0.18 mmでした。pH/活動曲線は、pH 8.9前後とpH 6.5の肩の最大値を示しました。共有結合されたフラビン補酵素と鉄硫黄クラスターの関与の証拠は、酸化されたマイナス基質還元酵素の差スペクトルから得られました。475、445、410、375、および350 nmの酸化酵素のピークまたは肩を備えています。ドデシル硫酸ナトリウム/ポリアクリルアミドゲルでは、酵素サブユニットは、7％酢酸または5％ホルムアルデヒドに固定した後、明るい黄色の蛍光を持っていました。ガラクトノラクトンオキシダーゼは安定しており、50％の活性が6か月で + 5度Cで失われます。
反応を触媒するSaccharomyces cerevisiaeの酵素：L-ガラクトノラクトン + O2はL-アスコルビン酸 + H2O2につながり、酵母ホモジネートのミトコンドリア画分から466倍精製されました。酵素には、nishikimi et al。[アーチ。生化学。生物生物。191、479-486（1978）]。デオキシ酸ナトリウムの存在下でのゲルろ過により、活性酵素について見かけのMRが70 000を得た。デオキシコレートの存在下でのポリアクリルアミド勾配ゲル電気泳動は74 000のMRを与えましたが、ドデシルスルル酸ナトリウム/ポリアクリルアミドゲル電気泳動は18 000のMRに対応する1つのタンパク質バンドのみを示しました。基質特異性は、アルドノ酸ラクトンL-ガラクトノ、d-アルトロノ、L-フコノ、D-アラビノ-1,4ラクトンに限定されています。L-GulonoおよびD-Galactono-1,4ラクトンでは、競合阻害が実証されました。P-クロロメルコリフェニルスルホン酸、ヨードアセトアミド、N-エチルマレイミド、硫酸、および硫化物はすべて酵素に対して阻害されました。シアン化物、アジド、EDTA、アルファ、アルファビピリジル、またはディスルホン酸塩菌を加えた場合、効果は見られませんでした。基質としてL-ガラクトノラクトンを含む0.3 mmの見かけのkmが見つかりました。酸素のkmは0.18 mmでした。pH/活動曲線は、pH 8.9前後とpH 6.5の肩の最大値を示しました。共有結合されたフラビン補酵素と鉄硫黄クラスターの関与の証拠は、酸化されたマイナス基質還元酵素の差スペクトルから得られました。475、445、410、375、および350 nmの酸化酵素のピークまたは肩を備えています。ドデシル硫酸ナトリウム/ポリアクリルアミドゲルでは、酵素サブユニットは、7％酢酸または5％ホルムアルデヒドに固定した後、明るい黄色の蛍光を持っていました。ガラクトノラクトンオキシダーゼは安定しており、50％の活性が6か月で + 5度Cで失われます。
An enzyme from Saccharomyces cerevisiae which catalyzes the reaction: L-galactonolactone + O2 leads to L-ascorbate + H2O2 has been purified 466-fold from the mitochondrial fraction of a yeast homogenate. The enzyme has several properties that are different from the L-galactonolactone oxidase described by Nishikimi et al. [Arch. Biochem. Biophys. 191, 479-486 (1978)]. By gel filtration in the presence of sodium deoxycholate an apparent Mr of 70 000 was obtained for the active enzyme. Polyacrylamide-gradient gel electrophoresis in the presence of deoxycholate gave an Mr of 74 000, whereas sodium dodecylsulfate/polyacrylamide gel electrophoresis showed only one protein band corresponding to an Mr of 18 000. A tetrameric structure of the enzyme is thereby suggested. The substrate specificity is confined to the aldonoacid lactones L-galactono-, D-altrono-, L-fucono-, D-arabino- and D-threono-1,4-lactones. Competitive inhibition was demonstrated with L-gulono- and D-galactono-1,4-lactones. p-Chloromercuriphenyl sulfonate, iodoacetamide, N-ethylmaleimide, sulfite and sulfide were all inhibitory to the enzyme. No effect was seen when cyanide, azide, EDTA, alpha, alpha'-bipyridyl or bathocuproine disulfonate was added. An apparent Km of 0.3 mM with L-galactonolactone as a substrate was found. The Km for oxygen was 0.18 mM. The pH/activity curve exhibited a maximum around pH 8.9 and a shoulder at pH 6.5. Evidence of a covalently bound flavin coenzyme and involvement of an iron-sulfur cluster was obtained from difference spectra of oxidized minus substrate-reduced enzyme with peaks or shoulders of the oxidized enzyme at 475, 445, 410, 375 and 350 nm. In sodium dodecylsulfate/polyacrylamide gels the enzyme subunit(s) had a bright yellow fluorescence after fixation in 7% acetic acid or 5% formaldehyde. The galactonolactone oxidase is stable with 50% activity being lost in 6 months at + 5 degrees C.
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