プリンヌクレオシド合成、ヌクレオシドホスホリラーゼを使用する効率的な方法

プリンヌクレオシドの酵素合成のための改善された方法について説明します。ピリミジンヌクレオシドをペントシルドナーとして使用し、2つのホスホリラーゼを触媒として使用しました。酵素の1つであるウリジンホスホリラーゼ（URD Pase）またはチミジンホスホリラーゼ（DTHD Pase）のいずれかが、ペントシルドナーのホスホロ分解を触媒しました。他の酵素であるプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（PN Pase）は、ピリミジンヌクレオシドのリン溶解から生成されたペントース1-リン酸エステルを利用することにより、生成ヌクレオシドの合成を触媒しました。ウルドペース、DTHD Pase、およびPN Paseは、リン酸カルシウムゲルによる滴定により、大腸菌の抽出物で互いに分離されました。各酵素は、イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製されました。これらの触媒の安定性に影響を与える要因が研究されました。URD Pase、DTHD Pase、およびPN Paseの安定性のpH最適化は、それぞれ7.6、6.5、および7.4でした。相対的な熱安定性の順序は、DTHD Paseよりも大きいPN Paseよりも大きいURD Paseでした。各酵素の安定性は、酵素濃度の増加とともに増加しました。この依存はDTHDペースで最も強く、URDペースで最も弱かった。テストした基質のうち、URD Pase、DTHD Pase、およびPN Paseの最も強力な安定剤は、それぞれウリジン、2'-デオキシリボース1-リン酸、およびリボース1-リン酸でした。収量の最適化に関するいくつかの一般的なガイドラインが与えられています。モデル反応では、低リン酸濃度で最適な生成物形成が得られました。この方法の効率の例として、6-（ジメチルアミノ）プリンの2'-デオキシリボヌクレオシドと2-アミノ-6-クロロプリンのリボヌクレオシドは、それぞれ81％と76％の収率で調製されました。

An improved method for the enzymatic synthesis of purine nucleosides is described. Pyrimidine nucleosides were used as pentosyl donors and two phosphorylases were used as catalysts. One of the enzymes, either uridine phosphorylase (Urd Pase) or thymidine phosphorylase (dThd Pase), catalyzed the phosphorolysis of the pentosyl donor. The other enzyme, purine nucleoside phosphorylase (PN Pase), catalyzed the synthesis of the product nucleoside by utilizing the pentose 1-phosphate ester generated from the phosphorolysis of the pyrimidine nucleoside. Urd Pase, dThd Pase, and PN Pase were separated from each other in extracts of Escherichia coli by titration with calcium phosphate gel. Each enzyme was further purified by ion-exchange chromatography. Factors that affect the stability of these catalysts were studied. The pH optima for the stability of Urd Pase, dThd Pase, and PN Pase were 7.6, 6.5, and 7.4, respectively. The order of relative heat stability was Urd Pase greater than PN Pase greater than dThd Pase. The stability of each enzyme increased with increasing enzyme concentration. This dependence was strongest with dThd Pase and weakest with Urd Pase. Of the substrates tested, the most potent stabilizers of Urd Pase, dThd Pase, and PN Pase were uridine, 2'-deoxyribose 1-phosphate, and ribose 1-phosphate, respectively. Some general guidelines for optimization of yields are given. In a model reaction, optimal product formation was obtained at low phosphate concentrations. As examples of the efficiency of the method, the 2'-deoxyribonucleoside of 6-(dimethylamino)purine and the ribonucleoside of 2-amino-6-chloropurine were prepared in yields of 81 and 76%, respectively.