一連のフラボタンパク質のフラビン位置8の溶媒アクセシビリティのフラボタンパク質のアクティブサイトプローブ測定

8-クロロフラビンと8-メルカプトフラビンの化学反応性は、溶媒と比較してタンパク質結合フラビンの方向を調べるために活用されています。一連のフラボタンパク質のアポタンパク質型を調製し、ネイティブフラビンを8-CL-フラビンまたは8-メルカプトフラビン（適切な場合はFAD、FMN、またはリボフラビン型）に置き換えました。再構成されたタンパク質は、8位のグループと反応できる試薬に曝露されました。8-CLタンパク質は硫化ナトリウムとチオフェノールで挑戦され、8メルカプトプロテインはヨードアセトアミドとヨード酢酸に直面していました。その後の反応の速度論は、タンパク質結合フラビンの位置8の溶媒利用可能性の尺度として機能しました。これらの研究は、フラビンの位置8がメリロテートヒドロキシラーゼ、D-アミノ酸オキシダーゼ、古い黄色の酵素、P-OH-ベンゾ酸ヒドロキシラーゼ、およびフラボドキシンに結合し、溶媒にアクセスできることを示しています。オキシダーゼ、およびリボフラビン結合タンパク質はアクセスできないようです。ルシフェラーゼ、D乳酸デヒドロゲナーゼ、およびキサンチンオキシダーゼの場合、データは位置8が露出しているが、結果は決定的ではないことを示唆しています。位置8のアクセシビリティに対するリガンド結合の効果も研究されました。8-メルカプトへのNADPH結合古い黄色の酵素と8-cl-d-アミノ酸オキシダーゼへのベンゾエート結合は、以前に入手可能な位置8の完全な閉塞をもたらします。（p-oh-benzoateおよびmelilotate）位置8の反応性を大幅に変えることなく。

The chemical reactivity of 8-chloroflavins and 8-mercaptoflavins has been exploited in order to examine the orientation of protein-bound flavins relative to solvent. The apoprotein form of a series of flavoproteins was prepared and the native flavin was replaced by either 8-Cl-flavin or 8-mercaptoflavin (FAD, FMN, or riboflavin form as was appropriate). The reconstituted proteins were exposed to reagents capable of reacting with the group at position 8. The 8-Cl-proteins were challenged with sodium sulfide and thiophenol, while the 8-mercaptoproteins were faced with iodoacetamide and iodoacetic acid. The kinetics of the ensuing reactions served as a measure of the solvent availability of position 8 for the protein-bound flavin. These studies indicated that position 8 of flavin bound to melilotate hydroxylase, D-amino acid oxidase, old yellow enzyme, p-OH-benzoate hydroxylase, and flavodoxin is accessible to solvent, while position 8 on L-lactate oxidase, glucose oxidase, putrescine oxidase, and riboflavin-binding protein appears to be inaccessible. For luciferase, D-lactate dehydrogenase, and xanthine oxidase, the data suggest that position 8 is exposed but the results are inconclusive. The effect of ligand binding on the accessibility of position 8 was also studied. NADPH binding to 8-mercapto old yellow enzyme and benzoate binding to 8-Cl-D-amino acid oxidase results in complete blockage of previously available position 8. On the other hand, p-OH-benzoate hydroxylase and melilotate hydroxylase bind their respective substrates (p-OH-benzoate and melilotate) without significantly altering the reactivity of position 8.