単一塩基置換変異体を使用することによるファイブロイン遺伝子プロモーターのin vitro特性評価

セグメント指向の突然変異誘発のための非常に効率的な方法が開発されました。この方法は、小さなDNA制限断片の分離された鎖の塩基の亜硝酸ナトリウムによる脱アミノ化に依存しています。変異剤処理鎖は、次の配列によって遷移変異を生成します：（i）ファージFLベクターにクローニングされた野生型DNAの相補的鎖とのハイブリダイゼーション、（ii）in vitroでの修復合成、および（iii）透過大腸菌の大腸菌。この方法を使用して、フィブロイン遺伝子の31塩基対ストレッチ内に14個の単一点変異体を分離しました（ヌクレオチド位置-30のT-A-T-Aボックスから+1のCAPサイトまで）。HeLa細胞または絹腺細胞抽出物によるin vitro転写実験は、T-A-T-Aボックス（-30でtからCから-29、および-28でTからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからCからTが遷移することを示しています。-20領域（gから-21、tからcから-20で、-17でaからaからaからプロモーター活性が低下しますが、キャップサイトと-10領域の領域は効果がありません。転写の開始部位は、5つの「ダウン」（活性の低下）変異体で同じです（-30でTからCからCからCからCからCから-21、AでAから-20、およびAにaG at -17）、CAP部位変異体（a〜g +1）、および野生型遺伝子-position +1。ただし、-29（T-A-T-Aボックスの2 base）でのA-gへの遷移は、位置+4から追加の転写開始を誘導します。T-A-T-Aボックスと-20領域の関数について説明します。

A highly efficient method for segment-directed mutagenesis has been developed. The method relies on the deamination by sodium nitrite of the bases in the separated strands of a small DNA restriction fragment. The mutagen-treated strands produce transition mutations by the following sequence: (i) hybridization with the complementary strand of the wild-type DNA that had been cloned into a phage fl vector, (ii) repair synthesis in vitro, and (iii) transfection of Escherichia coli. Using this method, we have isolated 14 single-point mutants within a 31-base-pair stretch of the fibroin gene (from the T-A-T-A box at the nucleotide position -30 to the cap site at +1). In vitro transcription experiments with the HeLa cell or the silk gland cell extract show that single-base transitions at the T-A-T-A box (T to C at -30, A to G at -29, and T to C at -28) and at the -20 region (G to A at -21, T to C at -20, and A to G at -17) result in decreased promoter activities, whereas those at the cap site and the -10 regions have no effect. The initiation site of transcription is the same for five "down" (reduced activity) mutants (T to C at -30, T to C at -28, G to A at -21, T to C at -20, and A to G at -17), the cap site mutant (A to G at +1), and the wild-type genes--position +1. However, the A-to-G transition at -29 (the second base of the T-A-T-A box) induces an additional transcription start from position +4. Functions of the T-A-T-A box and the -20 regions are discussed.