ローダミン123とフローサイトメトリーによって研究された生細胞との相互作用

特に生細胞のミトコンドリアに結合することが報告されたカチオン性蛍光炎のローダミン123（R123）は、さまざまな機能状態のさまざまな細胞タイプによる取り込みと、細胞の成長に対する色素のその後の効果に関して現在調査されました。細胞によって取り上げられたR123の発光スペクトルは、12 nmの赤方シフトを受け、複合体の形成を示唆しています。細胞はR123を急速に蓄積します。インキュベーションの温度（0〜37度）に関係なく、5〜10分後にほぼ最大結合に達します。培地中のR123濃度と、それぞれ平衡状態と非平衡条件下でそれぞれ0.1〜10.0および0.1〜5.0マイクログラムのR123の範囲を覆う細胞の色素蓄積との間には、それぞれ用量依存的な関係があります。細胞からの染料の漏れが発生し、染料を含まない培地への移動に続きます。漏れにもかかわらず、少なくとも2つの細胞分裂の後に細胞内色素を検出することができ、したがって、次のことを示しています。（a）R123標識細胞は分裂します。（b）分割中、標識されたミトコンドリアは娘細胞に分布しています。（c）R123はセルトレーサーとして使用できます。細胞死にはしばしば、R123蛍光の一時的な増加が伴います。死んだ細胞は、均一で強い蛍光を示すか、腫れたミトコンドリアを示唆する斑状の標識パターンを示します。時間（4〜8時間）とともに、死んだ細胞はR123とlyseを保持する能力を失います。静止からサイクルへの移行中に生細胞によるR123の摂取は増加し、友人の白血病細胞が赤血球分化を受けると減少が見られます。すべての場合において、R123の取り込みの変化は、細胞RNA含有量の変化と相関しています。R123とエチジウムまたはプロピジウムとの同時細胞染色は、細胞とその代謝状態の生存率、つまり増殖または運動性に関連する迅速なアッセイを提供します。MLあたり最大10マイクログラムのR123を持つ細胞のパルス標識は、即時の成長とクローニング効率に大きな影響を与えません。ただし、R123の連続的な存在では、細胞はG1Aコンパートメント、つまり初期のG1相で特異的に逮捕されます。細胞周期の速度論の詳細な分析により、すべての相の細胞の進行がR123を添加してから4時間後に遅くなることが明らかになりました。ただし、G1Aからの細胞出口は、R123の添加後2時間という早い時期に影響を受け、時間が経つにつれて、細胞はこのコンパートメントをまったく離れることができません。充電されていないローダミン染料（ローダミン110およびローダミンB）はミトコンドリアに蓄積せず、細胞周期に影響を与えません。R123の細胞質効果は、ミトコンドリア膜の色素特異性と細胞エネルギー代謝の破壊に照らして議論されており、細胞の入口に必要な必須成分（すなわち、リボソームRNA）の重要な含有量を達成できないことをもたらします。G1相の前提条件（G1B）コンパートメントに。

The cationic fluorochrome rhodamine 123 (R123), reported to bind specifically to mitochondria of living cells, was presently investigated with respect to its uptake by a variety of cell types in various functional states and the subsequent effect of the dye on cell growth. The emission spectrum of R123 taken up by cells undergoes a 12-nm red shift, suggesting formation of a complex. Cells accumulate R123 rapidly; near maximum binding is reached after 5 to 10 min, regardless of the temperature (0-37 degrees) of incubation. There is a dose-dependent relationship between R123 concentration in the medium and the dye accumulation in the cell that covers the range of 0.1 to 10.0 and 0.1 to 5.0 microgram of R123 per ml under equilibrium and nonequilibrium conditions, respectively. Some leakage of the dye from cells occurs, following their transfer into dye-free medium. Despite the leakage, the intracellular dye can be detected after at least two cell divisions, thus indicating that: (a) the R123-labeled cells divide; (b) during division, labeled mitochondria are distributed into the daughter cells; and (c) R123 may be used as a cell tracer. Cell death often is accompanied by a transient increase in R123 fluorescence. Dead cells exhibit either uniform, strong fluorescence or show a patchy labeling pattern suggesting swollen mitochondria. With time (4 to 8 hr), dead cells lose ability to retain R123 and lyse. Uptake of R123 by living cells is increased during the transition from quiescence into the cycle, and a decrease is seen when Friend leukemia cells undergo erythroid differentiation; in all cases, changes in R123 uptake are correlated with changes in cellular RNA content. Simultaneous cell staining with R123 and ethidium or propidium provides a rapid assay of the viability of the cells and their metabolic state, i.e., as related to proliferation or motility. Pulse-labeling of cells with up to 10 microgram of R123 per ml has no significant effect on their immediate growth and cloning efficiency. In the continuous presence of R123, however, cells become specifically arrested in the G1A compartment, i.e., in early G1 phase. Detailed analysis of the cell cycle kinetics reveals that cell progression through all phases is slowed 4 hr after addition of R123. Cell exit from G1A, however, is affected as early as 2 hr following addition of R123, and with time the cells are unable to leave this compartment at all. Uncharged rhodamine dyes (rhodamine 110 and rhodamine B) do not accumulate in mitochondria and are without effect on the cell cycle. The cytostatic effect of R123 is discussed in light of the dye specificity for mitochondrial membranes and the disruption of cell energy metabolism, resulting in the inability of the cells to attain a critical content of essential components (i.e., ribosomal RNA), necessary for cell entrance into the prereplicative (G1B) compartment of G1 phase.