in vitroでの転写のRNAポリメラーゼI-特異的開始のメカニズム：ATP要件と抑制されていない流出転写産物

ATP アナログ 5'-アデニリル イミド二リン酸 (AMP-PNP) は、全細胞抽出物に含まれる RNA ポリメラーゼ II による特定の遺伝子の転写を阻害します。これは、転写の最初のヌクレオチドとして A を含むプロモーターだけでなく、転写を開始するプロモーターも阻害します。アナログの AMP-PNP (ATP の競合阻害剤) はおそらく転写開始レベルで作用しますが、単離された核または全細胞抽出物中での RNA ポリメラーゼ II による伸長にも使用できます。AMP-PNP およびその他のイミド三リン酸は、精製 HeLa 細胞 RNA ポリメラーゼ II の開始および転写伸長にほとんど影響を与えません。粗製システムの RNA ポリメラーゼ III は、AMP-PNP による転写の開始と伸長の両方を行うため、ATP のベータ-ガンマ結合の利用可能性は、全体として RNA ポリメラーゼ II のみによる忠実かつ特異的な in vitro 開始にとって不可欠な要件であると結論付けます。細胞抽出物。キャップのない U または G 開始転写物は、それぞれのイミド二リン酸類似体である UMP-PNP または GMP-PNP の存在下で得られました。U で開始される前駆体のキャップと同じオリゴヌクレオチドに 5' 末端イミド三リン酸が存在することにより、転写開始とキャッピングが同じ部位で起こることが確立されました。in vitro システムにおける RNA ポリメラーゼ II による転写にはキャッピングは必要ありません。開始ヌクレオチドの 2' リボースのメチル化は、アデノウイルス EIV またはマウス白血病ウイルスの長末端反復配列の 5' 末端を含むイミドヌクレオチドでは起こりません。

The ATP analog 5'-adenylyl imidodiphosphate (AMP-PNP) inhibits transcription of specific genes by the RNA polymerase II contained in whole cell extracts, not only with promoters that contain A as the first nucleotide of the transcript, but also with those that initiate transcripts with G or U. The analog AMP-PNP (a competitive inhibitor of ATP) probably acts at the level of initiation of transcription, but it can be used for elongation by RNA polymerase II in isolated nuclei or in the whole cell extract. AMP-PNP and the other imidotriphosphates have little effect on purified HeLa cell RNA polymerase II initiation and elongation of transcription. Since RNA polymerase III in the crude system both initiates and elongates transcripts with AMP-PNP, we conclude that the availability of the beta-gamma bond of ATP is an indispensable requirement for faithful and specific in vitro initiation only by RNA polymerase II in the whole cell extract. Uncapped U- or G-initiated transcripts were obtained in the presence of UMP-PNP or GMP-PNP, the respective imidodiphosphate analogs. The presence of the 5'-terminal imidotriphosphate at the same oligonucleotide as the cap for U-initiated precursors established that transcription initiation and capping occur at the same site. Capping is not required for transcription by RNA polymerase II in the in vitro system. Methylation of the 2' ribose of the initiating nucleotide does not occur on the imidonucleotide containing 5' ends of adenovirus EIV or murine leukemia virus long terminal repeat.