化学プローブとの細胞膜リン脂質およびタンパク質の微分反応

この研究の主な目的は、リン脂質の非対称性の程度と、さまざまな種類の細胞膜におけるリン脂質の隣接分析を決定することでした。この研究では、貫通プローブ（FDNB）、非浸透プローブ（TNB）と架橋プローブ（DFDNB）が使用されました。DFNBおよびTNBSとの赤血球のヘモグロビン、膜タンパク質、および膜PEおよびPSの反応を、0.5〜10 mMプローブの濃度範囲で研究しました。TNBSは、濃度範囲0.4〜4 mmのヘモグロビンで非常に小さな伸びに反応しますが、FDNBはヘモグロビンと非常に大幅に反応します（TNBより50倍）。無傷の赤血球の膜タンパク質の反応は、1 mM TNBで鋭いプラトーに到達しますが、膜タンパク質の反応は、4 mM Fdnbまで見られないプラトーが見られないFDNBとはるかに大きくなります。このデータは、FDNBがセルに浸透するのに対し、TNBが私たちの条件下では有意に浸透しないことを示しています。結果は、外表面と比較して、赤血球膜の内面に局在するタンパク質に4つの折りたたみ式部位があることを示しています。0.5〜2 mmの濃度のTNBは、膜PSおよびラベル膜PEラベルを少し標識しません。PEとTNBSとの反応は、2 mMプローブでの初期プラトーと、4〜10 mMプローブの間の2番目のわずかに高いプラトーを示しています。0.5-2.0 mmのTNBはPSとは反応しませんが、3〜10 mmの濃度では、非常に少量のPSがTNBと反応します。したがって、2 mM TNBまたはFDNBを超えると、膜で摂動が発生し、より多くのPEとPSが露出し、これらのプローブと反応します。これらの結果は、本質的にPSが膜の外面に局在していないことを示しており、総膜PEの5％のみが赤血球膜の外面に局在していることを示しています。TNBSおよびFDNBは、酵母、大腸菌、およびアチョレプラズマ細胞と反応しました。酵母細胞を使用すると、FDNBはTNBよりもはるかに大きく反応し、FDNBが細胞に浸透し、より多くのPE分子にラベルが付いていることを示しています。大腸菌では、赤血球や酵母細胞を使用しない場合、リン酸化細胞はpH 8.5で非常に顕著であり、DNP-PEから大量のDNP-GPEを生み出しました。ホスホジエステラーゼも存在し、DNP-EthanolamineにDNP-GPEを加水分解しました。大腸菌細胞の包囲の多層構造は、結果の決定的な解釈を許可しませんでした。ただし、TNBSとFDNBは、このセルのPEと異なる程度に反応することは明らかです。アチョレプラズマ膜には検出可能なPEまたはPSはありませんでしたが、ホスファチジルグリセロールのアミノ酸エステルが含まれています。これらの成分とTNBおよびFDNBとの反応は、これらのアミノアシル-PGが膜の両方の表面に局在しており、31％が外面に、69％が内面にあることを示しています...

The major aims of this study were to determine the degree of phospholipid asymmetry and the neighbor analysis of phospholipids in different types of cell membranes. For this study a penetrating probe (FDNB), a non-penetrating probe (TNBS) and a cross-linking probe (DFDNB) were used. The reaction of hemoglobin, membrane protein and membrane PE and PS of erythrocytes with DFNB and TNBS was studied over a concentration range of 0.5 to 10 mM probe. TNBS reacts to an extremely small extend with hemoglobin over the concentration range 0.4 to 4 mM whereas FDNB reacts with hemoglobin to a very large extent (50 fold more than TNBS). The reaction of membrane protein of intact erythrocytes reaches a sharp plateau at 1 mM TNBS whereas the reaction of membrane protein goes to a much larger extent with FDNB with no plateau seen up to 4 mM FDNB. This data shows that TNBS does not significantly penetrate into the cell under our conditions whereas FDNB does penetrate into the cell. The results show that there are four fold more reactive sites on proteins localized on the inner surface of the erythrocyte membrane as compared to the outer surface. TNBS at 0.5 to 2 mM concentration does not label membrane PS and labels membrane PE to a small extent. The reaction of PE with TNBS shows an initial plateau at 2 mM probe and a second slightly higher plateau between 4 to 10 mM probe. TNBS from 0.5-2.0 mM does not react with PS, but between 3 to 10 mM concentration, a very small amount of PS reacts with TNBS. Hence above 2 mM TNBS or FDNB a perturbation occurs in the membrane such that more PE and PS are exposed and react with these probes. These results demonstrate that essentially no PS is localized on the outer surface of the membrane and only 5% of the total membrane PE is localized on the outer surface of the erythrocyte membrane. TNBS and FDNB were reacted with yeast, E. coli, and Acholeplasma cells. With yeast cells, FDNB reacts to a much larger extent with PE than does TNBS, indicating that FDNB penetrates into the cell and labels more PE molecules. With E. coli, but not with erythrocytes or yeast cells, phospholipase A activity was very pronounced at pH 8.5 giving rise to a large amount of DNP-GPE from DNP-PE. A phosphodiesterase was also present which hydrolyized DNP-GPE to DNP-ethanolamine. The multilayered structure of the E. coli cell envelop did not permit a definitive interpretation of the results. It is clear, however, that TNBS and FDNB react to a different extent with PE in this cell. The Acholeplasma membrane had no detectable PE or PS but contains amino acid esters of phosphatidylglycerol. The reaction of these components with TNBS and FDNB indicate that these aminoacyl-PG are localized on both surfaces of the membrane, with 31% being on the outer surface and 69% on the inner surface...