アマスタチンを用いたアフィニティークロマトグラフィーによる精製とブタ腎臓由来のアミノペプチダーゼ A の特性

1. アミノペプチダーゼ A (L-アルファ-アスパルチル(L-アルファ-グルタミル)-ペプチド ヒドロラーゼ、EC 3.4.11.7) の特異的阻害剤であるアマスタチンをアガロースマトリックスに結合し、このアフィニティー クロマトグラフィーによってブタ腎臓のアミノペプチダーゼ A を単一タンパク質として精製しました (アクリルアミド ゲル電気泳動で示されました)。2. 710倍に精製したアミノペプチダーゼAは、酸性アミノ酸β-ナフチルアミドのみを加水分解しました。至適pHは7.5、至適温度は45〜50℃であった。3. 分子量は約 100 mA であった。Sephadex G-200 ゲル濾過により測定すると 300,000。4. アミノペプチダーゼ A の活性は、スルフヒドリル剤、S-S 解離剤、セリンプロテイナーゼ阻害剤の影響を受けませんでしたが、金属キレート剤により強く阻害され、アルカリ土類金属により増強されました。5. アマスタチンは L-グルタミン酸 β-ナフチルアミドと競合的にアミノペプチダーゼ A を阻害し、Ki 値は 2.5 x 10(-7) M と計算されました。アミノペプチダーゼ A に対するアマスタチンの阻害効果は、Ca2+ の添加によって逆転しませんでした。

1. Amastatin, a specific inhibitor of aminopeptidase A (L-alpha-aspartyl(L-alpha-glutamyl)-peptide hydrolase, EC 3.4.11.7), was linked to an agarose matrix and by this affinity chromatography aminopeptidase A of pig kidneys was purified as a single protein shown by acrylamide gel electrophoresis. 2. Aminopeptidase A which was purified 710-fold, hydrolyzed only acidic amino acid beta-naphthylamide. The optimum pH and the optimum temperature was 7.5 and 45-50 degrees C, respectively. 3. The molecular weight was approx. 300 000 as determined by Sephadex G-200 gel filtration. 4. The activity of aminopeptidase A was not affected by sulfhydryl agents, S-S dissociating agents and serine proteinase inhibitor, but was inhibited strongly by metal chelating agents, and enhanced by alkaline earth metals. 5. Amastatin inhibited aminopeptidase A in a competitive manner with L-glutamic acid beta-naphthylamide, and the Ki value was calculated to be 2.5 x 10(-7) M. The inhibitory effect of amastatin on aminopeptidase A was not reversed by addition of Ca2+.