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Analytical biochemistry1994Mar01Vol.217issue(2)

マルチウェルプレートでの急速なろ過によってアルシアンブルーに複合された35S標識プロテオグリカンの定量化

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文献タイプ:
  • Comparative Study
  • Journal Article
  • Research Support, Non-U.S. Gov't
  • Research Support, U.S. Gov't, P.H.S.
概要
Abstract

このホワイトペーパーでは、多数のサンプル中の35S標識プロテオグリカンおよび/または35S標識グリコサミノグリカンの定量化のための迅速なろ過アッセイについて説明します。未成年型[35S]硫酸からの35S標識プロテオグリカンと35S標識グリコサミノグリカンの分離は、アルシアンブルーとグリコサミノグリカンの間の不溶性複合体を形成することにより、プロテオグリのグリコサミノグリカン地域の間の不溶性複合体を形成することにより影響を受け、「durapore papore paporane」を介して「durapore paporens」を介してろ過をフィルタリングします。96ウェルプレートで。短いすすぎステップに続いて、ディスクがパンチアウトされ、膜に保持されている35S標識高分子がシンチレーションカウントによって定量化されます。この急速なろ過アッセイでは、測定された[35S] - アグレカンの塗布量と放射能の関係は、広範囲の濃度(2〜800マイクログラムAggrecan/ml)で線形でした。培地で測定された35S標識プロテオグリカンと、関節軟骨の4 MグアニジンHCl抽出物と3つの異なる軟骨細胞培養システム(単層、アガロースゲル、およびアルギン酸ビード)の量は、Sephadex G-25のシーブクロマトグラフィーによって得られた値の90〜101%の範囲でした。非標識プロテオグリカン(最大1 mg/ml)、ウシ血清アルブミン(最大4 mg/ml)、DNA(最大20マイクログラム/mL)、血清(最大30%)、または4 Mの塩酸塩グアニジンの存在は、35S覚えたプロテオグリンの回収に影響を与えませんでした。セファデックスG-25のクロマトグラフィーによって定量化された35S標識プロテオグリカンまたは35S標識グリコサミノグリカンとろ過アッセイは、培養培地、抽出物、または消化器のタイプに関係なく強い線形関係(r> 0.99)を示しました。

このホワイトペーパーでは、多数のサンプル中の35S標識プロテオグリカンおよび/または35S標識グリコサミノグリカンの定量化のための迅速なろ過アッセイについて説明します。未成年型[35S]硫酸からの35S標識プロテオグリカンと35S標識グリコサミノグリカンの分離は、アルシアンブルーとグリコサミノグリカンの間の不溶性複合体を形成することにより、プロテオグリのグリコサミノグリカン地域の間の不溶性複合体を形成することにより影響を受け、「durapore papore paporane」を介して「durapore paporens」を介してろ過をフィルタリングします。96ウェルプレートで。短いすすぎステップに続いて、ディスクがパンチアウトされ、膜に保持されている35S標識高分子がシンチレーションカウントによって定量化されます。この急速なろ過アッセイでは、測定された[35S] - アグレカンの塗布量と放射能の関係は、広範囲の濃度(2〜800マイクログラムAggrecan/ml)で線形でした。培地で測定された35S標識プロテオグリカンと、関節軟骨の4 MグアニジンHCl抽出物と3つの異なる軟骨細胞培養システム(単層、アガロースゲル、およびアルギン酸ビード)の量は、Sephadex G-25のシーブクロマトグラフィーによって得られた値の90〜101%の範囲でした。非標識プロテオグリカン(最大1 mg/ml)、ウシ血清アルブミン(最大4 mg/ml)、DNA(最大20マイクログラム/mL)、血清(最大30%)、または4 Mの塩酸塩グアニジンの存在は、35S覚えたプロテオグリンの回収に影響を与えませんでした。セファデックスG-25のクロマトグラフィーによって定量化された35S標識プロテオグリカンまたは35S標識グリコサミノグリカンとろ過アッセイは、培養培地、抽出物、または消化器のタイプに関係なく強い線形関係(r> 0.99)を示しました。

This paper describes a rapid filtration assay for the quantification of 35S-labeled proteoglycans and/or 35S-labeled glycosaminoglycans in a large number of samples. Separation of 35S-labeled proteoglycans and 35S-labeled glycosaminoglycans from unincorporated [35S]sulfate is effected by forming insoluble complexes between alcian blue and the glycosaminoglycan moieties of the proteoglycans and then filtering the solutions through "Durapore membrane" discs (0.45 microns pore size) fitted in a 96-well plate. Following brief rinsing steps, the discs are punched out and 35S-labeled macromolecules retained on the membrane are then quantified by scintillation counting. In this rapid filtration assay, the relationship between the amount of [35S]-aggrecan applied and radioactivity measured was linear over a broad range of concentrations (2-800 micrograms aggrecan/ml). The amount of 35S-labeled proteoglycans measured in media and 4 M guanidine HCl extracts of articular cartilage and three different chondrocyte culture systems (monolayer, agarose gel, and alginate bead) ranged between 90 and 101% of the value obtained by sieve chromatography on Sephadex G-25. The presence in samples of unlabeled proteoglycans (up to 1 mg/ml), bovine serum albumin (up to 4 mg/ml), DNA (up to 20 micrograms/ml), serum (up to 30%), or guanidine hydrochloride at 4 M did not affect recovery of 35S-labeled proteoglycans measurably. CPM values obtained for 35S-labeled proteoglycans or 35S-labeled glycosaminoglycans quantified by chromatography on Sephadex G-25 and the filtration assay showed a strong linear relationship (r > 0.99) irrespective of the type of culture medium, extract, or digest used.

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