モノクローナル抗体を使用したアンジオテンシンI変換酵素の構造機能分析アミノ末端活性部位の選択的阻害

アンジオテンシンI変換酵素（ACE; Kininase II）には、2つの非常に類似したドメイン（NH2およびCOOH末端ドメイン（それぞれNおよびCドメイン））が含まれており、それぞれが活性部位を担います。これらの活性部位は同じペプチドを加水分解しますが、同じ触媒特性と基質特異性はありません。ドメイン固有の免疫学的プローブを開発しようとすると、2つのモノクローナル抗体（mAb）、19のクローンの2つのシリーズが生成され、ヒトACEに対してテストされました。これらのmAbは、ACE分子の3つの抗原領域内で少なくとも9つの異なるエピトープを認識しました。野生型組換えエースと1つの無傷のドメインのみを持ついくつかの変異体のテストは、これらのエピトープがすべてNドメインにあることを示しました。MABはどれもCドメインを認識していませんでした。ヒトACEに対するいくつかのポリクローナル抗体で得られた結果のこの特異性と分析は、ACE免疫原性が主にNドメインによって決定されることを示唆しています。ACEのさまざまな抗原領域のエピトープを認識する2つのmAb（3A5およびI2H5）は、Nの酵素活性を阻害しました（Cではなく）ドメイン。mAb 3a5は、カリッピリル-his-leu、ベンジルオキシカルボニル - ヒスレウ、およびアンジオテンシンI加水分解に対して同じ阻害効力を有していました。ベンジルオキシカルボニル-His-His-Leuおよび天然基質のアンジオテンシンIおよびブラジキニンの加水分解を阻害するmab 3a5よりも（モル比1-2で50％阻害）が、カリッポリルヒス-Leuクリーベージの阻害にはあまり効果的ではありませんでした（5022-25のモル比での％阻害。この基質が特定のサブサイトと相互作用することを示しています。MAB I2H5は、分離されたNドメインによる黄体形成ホルモン放出ホルモンの加水分解をほぼ完全に阻害しました。このペプチドの主要なカルボキシルおよびアミノ末端切断の両方が抑制されました。この抗体は、野生型エースによる黄体形成ホルモン放出ホルモンの一次アミノ末端切断を90％> 90％抑制し、この特定のACE機能が主にNドメイン活性部位によって媒介されることを示しています。これらのデータは、高度な配列相同性にもかかわらず、ACEの2つの相同領域間の構造的違いの証拠を提供し、モノクローナル抗体がACEの2つの活性部位を区別できることを示しています。

Angiotensin I-converting enzyme (ACE; kininase II) contains two very similar domains (the NH2- and COOH-terminal domains (N and C domains, respectively)), each bearing an active site. These active sites hydrolyze the same peptides, but do not have the same catalytic properties and substrate specificities. In an attempt to develop domain-specific immunological probes, two series of monoclonal antibodies (mAbs), 19 clones in all, were produced and tested against human ACE. These mAbs recognized at least nine different epitopes within three antigenic regions of the ACE molecule. Testing on wild-type recombinant ACE and several mutants with only one intact domain showed that these epitopes were all located in the N domain. None of the mAbs recognized the C domain. This particular specificity and analysis of results obtained with several polyclonal antibodies to human ACE suggest that ACE immunogenicity is determined mainly by the N domain. Two mAbs (3A5 and i2H5) recognizing epitopes from different antigenic regions of ACE inhibited the enzymatic activity of the N (but not of the C) domain. mAb 3A5 had the same inhibitory potency toward hippuryl-His-Leu, benzyloxycarbonyl-Phe-His-Leu, and angiotensin I hydrolysis, with 50% inhibition achieved at a mAb/ACE molar ratio of 6. mAb i2H5 was roughly three times more effective than mAb 3A5 inhibiting the hydrolysis of benzyloxycarbonyl-Phe-His-Leu and the natural substrates angiotensin I and bradykinin (50% inhibition at a molar ratio of 1-2), but was less effective in inhibiting hippuryl-His-Leu cleavage (50% inhibition at a molar ratio of 22-25), indicating that this substrate interacts with a specific subsite. mAb i2H5 almost completely inhibited the hydrolysis of the luteinizing hormone-releasing hormone by the isolated N domain. Both the primary carboxyl- and amino-terminal cleavages of this peptide were suppressed. This antibody suppressed the primary amino-terminal cleavage of the luteinizing hormone-releasing hormone by wild-type ACE by > 90%, indicating that this particular ACE function is mediated mainly by the N domain active site. These data provide evidence for structural differences between the two homologous domains of ACE despite their high degree of sequence homology and show that monoclonal antibodies are able to distinguish between the two active sites in ACE.