エンドソームアルカリ化は、OK細胞のアルブミン受容体媒介エンドサイトーシスのJMAXとKMを減少させます

この研究では、無傷の近位尿細管由来オポッサム腎細胞におけるエンドサイトーシス取り込みの動態に対するエンドソームアルカリ化の効果を調査しました。受容体媒介エンドサイトーシスおよび液相エンドサイトーシスのエンドサイトーシス基質として、それぞれエンドサイトーシス基質として、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識アルブミンとFITC-デキストランを使用しました。FITC-アルブミンまたはFITC-Dextranのいずれかで標識されたエンドソームのpHは、液胞型ATPase阻害剤、BafiloMycin A1、およびNH4Clの存在下で上昇しました。細胞質pHは、バフィロマイシンA1の存在下で減少しましたが、細胞をNH4Clに延長する際のコントロールと有意な差はありませんでした。FITC-Dextranのエンドサイトーシス取り込みは、エンドソームpHの変化の影響を受けませんでした。FITC-アルブミンのエンドサイトーシス取り込みは、バフィロマイシンA1（最大輸送速度の低下と見かけの親和性）によって著しく減少しました。NH4Clを使用したエンドソームの選択的アルカリ酸化（すなわち、細胞質pHがコントロールと違いはない）を使用して、同様の方法でFITC-アルブミンの取り込みを減少させましたが、BafiloMycin A1よりも低い程度は低下しました。細胞内アルブミン分解は、Bafilomycin A1およびNH4Clによって損なわれました。エンドソーム - リソソーム融合の予防（温度を20度Cに下げる）は、エンドソームアルカリ化の影響を廃止しました。さらに、アルブミンの血漿膜への特異的結合は、Bafilomycin A1とのインキュベーション後に減少し、受容体のリサイクルの障害を示しています。これらのデータは、エンドソームpHが近位尿細管中のアルブミンの受容体媒介エンドサイトーシス取り込みの速度論の重要な決定因子であるが、液相エンドサイトーシスではないことを示しています。エンドソームアルカリ化は、細胞内リガンドの取り扱いと受容体の輸送を妨害し、エンドサイトーシス能力と親和性の低下につながります。

In this study, we investigated the effects of endosomal alkalinization on kinetics of endocytotic uptake in intact proximal tubule-derived opossum kidney cells. We used fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled albumin and FITC-dextran as endocytotic substrates for receptor-mediated endocytosis and fluid-phase endocytosis, respectively. The pH in endosomes labeled with either FITC-albumin or FITC-dextran rose in the presence of the vacuolar-type ATPase inhibitor, bafilomycin A1, and in the presence of NH4Cl. Cytoplasmic pH, decreased in the presence of bafilomycin A1, but was not significantly different from control during prolonged exposure of the cells to NH4Cl. Endocytotic uptake of FITC-dextran was not affected by endosomal pH changes. Endocytotic uptake of FITC-albumin was reduced markedly by bafilomycin A1 (decrease of maximum transport rate and apparent affinity). Selective alkalinization of endosomes using NH4Cl (i.e., with the cytoplasmic pH not different from control) reduced FITC-albumin uptake in a similar way but to a lesser extent than did bafilomycin A1. Intracellular albumin degradation was impaired by bafilomycin A1 and NH4Cl. Prevention of endosome-lysosome fusion (lowering the temperature to 20 degrees C) abolished the effects of endosomal alkalinization. Furthermore, specific binding of albumin to the plasma membrane was reduced after incubation with bafilomycin A1, indicating an impairment of receptor recycling. These data show that endosomal pH is an important determinant for the kinetics of receptor-mediated endocytotic uptake of albumin in the proximal tubule but not for fluid-phase endocytosis. Endosomal alkalinization disturbs intracellular ligand handling and receptor trafficking, leading to a reduction of endocytotic capacity and affinity.