ダブシル誘導体化を使用した加水分解された細胞抽出物に存在するホスホリルヒドロキシアミノ酸の分析

32p標識A431細胞の酸加水分解抽出物におけるダブシル誘導体として、ホスホセリン、ホスホトレオニン、およびホスホチロシンを定量化するための新しい方法を開発しました。最初のステップでは、ホスファミノ酸は使い捨ての陰イオン交換カラムを使用して濃縮されます。その後、ホスホアミノ酸画分は、2番目の陰イオン交換カラムでクリーンアップした後、廃棄可能なC18カラムで分離した後、コラル修飾ホスホアミノ酸をシリカで分離した後、70度で10分間、ダブシル試薬（28.8 mm）で10分間処理されます。1次元溶媒システムを使用したTLCシート。この方法の主な利点は、加水分解された細胞抽出物に由来する32p汚染物質の干渉なしに、非常に再現可能な方法で、シリカアルミニウムシート上のダブシル化P-SER、P-TH、およびP-Tyrの完全な分離です。非常にきれいなクロマトグラムが得られ、アルミニウムシートからの関連するスポットを単純に削減することにより、ホスホアミノ酸の高速で明確な定量化を可能にします。サンプルの誘導体化前に、アミノ酸を除去することにより、高い感度が達成されます。これにより、比較的少ない量の[32p]オルトリン酸を使用して細胞を積み込むことができます。最も重要なことは、この方法により、1日以内に数十のサンプルの同時分析が可能になり、培養細胞のリン酸化状態の日常的な分析のための非常に便利な手法となることです。したがって、この方法は、全細胞研究におけるプロテインキナーゼ、たとえばPTK阻害剤の阻害剤の大規模なスクリーニングでの実装に非常に適しています。

We have developed a new method for the quantification of phosphoserine, phosphothreonine, and phosphotyrosine as dabsyl derivatives in acid-hydrolyzed extracts of 32P-labeled A431 cells. In the first step the phosphamino acids are concentrated using a disposable anion-exchange column. Subsequently, the phosphoamino acid fraction is treated with dabsyl reagent (28.8 mM) for 10 min at 70 degrees C. After cleanup with a second anion-exchange column followed by separation on a disposable C18 column, the covalently modified phosphoamino acids are separated on silica TLC sheets using a one-dimensional solvent system. The major advantages of this method are the complete separation of dabsylated P-Ser, P-Thr, and P-Tyr on silica aluminum sheets in a very reproducible way without the interference of 32P contaminants originating from hydrolyzed cell extracts. Very clean chromatograms are obtained, enabling the fast and unambiguous quantification of the phosphoamino acids by simply cutting out the relevant spots from the aluminum sheets. A high sensitivity is achieved by the removal of the amino acids before derivatization of the sample. This allows the use of relatively low amounts of [32P]orthophosphate to load up the cells. Most important, the method allows the simultaneous analysis of dozens of samples within 1 day, making it a very convenient technique for routine analysis of the phosphorylation state of cultured cells. Consequently the method is well suited to implementation in large screenings for inhibitors of protein kinases, e.g., PTK inhibitors, in whole-cell studies.