カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIの調節領域Iには、密接に関連する自己阻害およびカルモジュリン結合ドメインが含まれています

Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼI（CamキナーゼI）の調節のメカニズムを、一連のCOOH末端切り捨てされた変異体を使用して調査しました。これらの変異体は、グルタチオンS-トランスフェラーゼを含む融合タンパク質として細菌で発現し、グルタチオンセファロース4bを使用してアフィニティクロマトグラフィーによって精製されました。変異体（残基1-332）は、完全なCa2+/CAM依存的活性を示しました。切り捨て変異体（残基1-321、1-314、および1-309）は、Ca2+/CAMの親和性の低下を示し、Ca2+/CAM依存性の減少も示しました。切り捨て変異体（残基1-305または1-299）はCa2+/CAMに結合することができず、不活性でした。対照的に、切り捨て変異体（残基1-293または1-277）は、完全に活性なカムキナーゼIよりもわずかに高いレベル（2倍）で構成的に活性化されていました。これらの結果は、CAM上のCA2+/CAM結合ドメインの位置を示しています。キナーゼI（残基294-321）およびCa2+/CAM結合ドメインの近く、または重複する自己阻害ドメインの存在を予測します。これらの結論は、カムキナーゼIの残基294-321に対応する合成ペプチド（カムキナーゼI（294-321））がCA2+/CAMと競合する方法で完全に活性なキナーゼを阻害したことを示した研究によって支持されました。構成的に活性な変異体（残基1-293）は、ペプチド基質（Ki = 1.2 microM）であるシスタイド-2と競合するが、ATPとは競争力がなかった。したがって、これらの結果は、Ca2+/CAM依存性プロテインキナーゼの他のメンバーに共通する中球メカニズムを通じてCAMキナーゼIが調節されることを示唆しています。

The mechanism for the regulation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase I (CaM kinase I) was investigated using a series of COOH-terminal truncated mutants. These mutants were expressed in bacteria as fusion proteins with glutathione S-transferase and purified by affinity chromatography using glutathione Sepharose 4B. A mutant (residues 1-332) showed complete Ca2+/CaM-dependent activity. Truncation mutants (residues 1-321, 1-314, and 1-309) exhibited decreasing affinities for Ca2+/CaM and also exhibited decreasing Ca2+/CaM-dependent activities. Truncation mutants (residues 1-305 or 1-299) were unable to bind Ca2+/CaM and were inactive. In contrast, truncation mutants (residues 1-293 or 1-277) were constitutively active at a slightly higher level (2-fold) than fully active CaM kinase I. These results indicate the location of the Ca2+/CaM-binding domain on CaM kinase I (residues 294-321) and predict the existence of an autoinhibitory domain near, or overlapping, the Ca2+/CaM-binding domain. These conclusions were supported by studies which showed that a synthetic peptide (CaM kinase I (294-321)) corresponding to residues 294-321 of CaM kinase I inhibited the fully active kinase in a manner that was competitive with Ca2+/CaM and also inhibited the constitutively active mutant (residues 1-293) in a manner that was competitive with Syntide-2, a peptide substrate, (Ki = 1.2 microM) but was non-competitive with ATP. Thus, these results suggest that CaM kinase I is regulated through an intrasteric mechanism common to other members of the family of Ca2+/CaM-dependent protein kinases.