反対側に蛍光色素を含むオリゴヌクレオチドは、PCR産物と核酸ハイブリダイゼーションの検出に役立つクエンチーズプローブシステムを提供します

5 'ヌクレアーゼPCRアッセイは、増幅反応中の二重標識蛍光プローブのハイブリダイゼーションと切断により、特定のPCR産物の蓄積を検出します。このプローブは、レポーター蛍光色素とクエンチャー染料の両方を備えたオリゴヌクレオチドです。レポーターの蛍光強度の増加は、プローブが標的PCR産物にハイブリダイズされており、Taq DNAポリメラーゼの5 '> 3'核分解活性によって切断されていることを示しています。この研究では、内部ヌクレオチドに付着したクエンチャー染料を含むプローブを、3 '末端ヌクレオチドに結合したクエンチャー染料と一緒にプローブと比較しました。すべての場合において、レポーター染料は5 '端に取り付けられました。すべての無傷のプローブは、レポーター蛍光の消光を示しました。一般に、3'末端ヌクレオチドに接続されたクエンチャー色素を含むプローブは、5 'ヌクレアーゼPCRアッセイで内部標識されたプローブよりも大きなシグナルを示しました。PCR中にプローブがテンプレート鎖にハイブリダイズされている場合、TAQ DNAポリメラーゼによる切断の可能性の増加が原因であることが提案されています。3 '末端ヌクレオチドに接続されたクエンチャー染料を含むプローブは、相補的な鎖にハイブリダイズするとレポーター蛍光強度の増加も示しました。したがって、反対側に付着したレポーターとクエンチャー染料を備えたオリゴヌクレオチドは、均一なハイブリダイゼーションプローブとして使用できます。

The 5' nuclease PCR assay detects the accumulation of specific PCR product by hybridization and cleavage of a double-labeled fluorogenic probe during the amplification reaction. The probe is an oligonucleotide with both a reporter fluorescent dye and a quencher dye attached. An increase in reporter fluorescence intensity indicates that the probe has hybridized to the target PCR product and has been cleaved by the 5'-->3' nucleolytic activity of Taq DNA polymerase. In this study, probes with the quencher dye attached to an internal nucleotide were compared with probes with the quencher dye attached to the 3'-end nucleotide. In all cases, the reporter dye was attached to the 5' end. All intact probes showed quenching of the reporter fluorescence. In general, probes with the quencher dye attached to the 3'-end nucleotide exhibited a larger signal in the 5' nuclease PCR assay than the internally labeled probes. It is proposed that the larger signal is caused by increased likelihood of cleavage by Taq DNA polymerase when the probe is hybridized to a template strand during PCR. Probes with the quencher dye attached to the 3'-end nucleotide also exhibited an increase in reporter fluorescence intensity when hybridized to a complementary strand. Thus, oligonucleotides with reporter and quencher dyes attached at opposite ends can be used as homogeneous hybridization probes.