過酸化水素誘導性カタラーゼをコードする緑膿菌の katB 遺伝子のクローニングと特徴付け: KatB の精製、細胞局在化、過酸化水素に対する最適な耐性に不可欠であることの実証

Pseudomonas aeruginosaは、環境で実質的にユビキタスな義務的なエアロベです。好気性呼吸中、二酸化生の代謝は、過酸化水素を含む活性酸素中間体の産生につながる可能性があります。この化合物の潜在的に毒性効果に対抗するために、緑膿菌は過酸化水素を解毒する2つのヘム含有カタラーゼを所有しています。この研究では、Katbをクローニングし、緑膿菌の1つのカタラーゼ遺伝子をコードしました。遺伝子は5.4 kbのECORIフラグメントでクローニングされ、513アミノ酸をコードする1,539 bpで構成されています。P. aeruginosa katbのアミノ酸配列は、関連する種のカタラーゼPseudomonas syringaeのアミノ酸配列と同じでした。KATB遺伝子は、マンガンとスーパーオキシド鉄の両方のジスムターゼの両方をコードするソーダとSODB遺伝子の両方を抱える同一の領域である緑膿菌染色体の71〜75分間の領域にマッピングされました。大腸菌のカタラーゼ欠損変異体（UM255）にクローン化されたとき、組換え緑膿菌KATBを発現させ（229 U/mg）、野生型E. coli株のそれとほぼ同等の過酸化水素に対するこのひずみ耐性を与えました。（HB101）。KATBタンパク質は均一性に精製され、約228 kDaの四量体であると判断されました。これは、翻訳されたKATB遺伝子に由来する予測タンパク質サイズとよく一致していました。興味深いことに、KATBは正常な緑膿菌成長サイクル中に産生されず、カタラーゼ活性はムコイド、アルギン酸塩産生の生物よりも粘液性が大きかった。過酸化水素にさらされ、より大きな程度までパラコートにさらされると、総カタラーゼ活性はそれぞれ7〜16倍上昇しました。さらに、KATB活性の増加により、過酸化水素に対する耐性が著しく増加しました。KATBは細胞質に局在していましたが、「ハウスキーピング」酵素であるKataは細胞質抽出物と周期抽出物の両方で検出されました。緑膿菌KATB変異体は、野生型菌よりも過酸化水素に対する50％の感度が高いことを示し、KATBはP. aeroginosaの外因性過酸化水素に対する最適な耐性に不可欠であることを示唆しています。

Pseudomonas aeruginosa is an obligate aerobe that is virtually ubiquitous in the environment. During aerobic respiration, the metabolism of dioxygen can lead to the production of reactive oxygen intermediates, one of which includes hydrogen peroxide. To counteract the potentially toxic effects of this compound, P. aeruginosa possesses two heme-containing catalases which detoxify hydrogen peroxide. In this study, we have cloned katB, encoding one catalase gene of P. aeruginosa. The gene was cloned on a 5.4-kb EcoRI fragment and is composed of 1,539 bp, encoding 513 amino acids. The amino acid sequence of the P. aeruginosa katB was approximately 65% identical to that of a catalase from a related species, Pseudomonas syringae. The katB gene was mapped to the 71- to 75-min region of the P. aeruginosa chromosome, the identical region which harbors both sodA and sodB genes encoding both manganese and iron superoxide dismutases. When cloned into a catalase-deficient mutant of Escherichia coli (UM255), the recombinant P. aeruginosa KatB was expressed (229 U/mg) and afforded this strain resistance to hydrogen peroxide nearly equivalent to that of the wild-type E. coli strain (HB101). The KatB protein was purified to homogeneity and determined to be a tetramer of approximately 228 kDa, which was in good agreement with the predicted protein size derived from the translated katB gene. Interestingly, KatB was not produced during the normal P. aeruginosa growth cycle, and catalase activity was greater in nonmucoid than in mucoid, alginate-producing organisms. When exposed to hydrogen peroxide and, to a greater extent, paraquat, total catalase activity was elevated 7- to 16-fold, respectively. In addition, an increase in KatB activity caused a marked increase in resistance to hydrogen peroxide. KatB was localized to the cytoplasm, while KatA, the "housekeeping" enzyme, was detected in both cytoplasmic and periplasmic extracts. A P. aeruginosa katB mutant demonstrated 50% greater sensitivity to hydrogen peroxide than wild-type bacteria, suggesting that KatB is essential for optimal resistance of P. aeroginosa to exogenous hydrogen peroxide.