ヒトKB細胞葉酸受容体遺伝子P4プロモーターの構造的および機能分析：基底プロモーター活性のためのイニシエーター領域との3つのクラスター化されたSP1結合部位の協力

ヒト葉酸受容体（HFR）は、葉酸塩と抗フォレートの細胞蓄積において重要です。ヒトKB細胞FR（HFR-KB）遺伝子の構造について説明し、エクソン1と4から上流の2つの離散プロモーター領域（P1およびP4）をそれぞれ同定しました（Elwood et al。、1993）。HFR発現の分子基盤をさらに理解するために、主要な転写開始部位の上流のP4プロモーターの基礎転写を分析しました。エクソン4の上流のシーケンスには、いくつかの潜在的な転写因子結合部位と、転写開始部位でのコンセンサスイニシエーター領域シーケンスが含まれていますが、標準的なTATAまたはCAATボックスは含まれていません。P4プロモーター領域のNT -1023からNT -605への5 '隣接配列の削除は、KB細胞のルシフェラーゼレポーター遺伝子発現をコントロールコンストラクトの54〜70％に減少させますが、NT -292とNT -NT -の間の配列の除去は減少します。46は、活動を3％に著しく減少させます。DNase Iフットプリントと競争力のあるモビリティシフトおよびスーパーシフトモビリティアッセイは、SP1またはSP1関連の核タンパク質がHFR-KB P4プロモーターのNT -292とNT -46の間のシーケンス内の3つのクラスター化されたGCリッチ領域に結合することを示しています。これら3つのSP1結合部位とイニシエーターシーケンスの部位特異的変異を含むプロモーターコンストラクトの発現のin vitroおよびin vivo分析の両方で、3つのSP1部位とイニシエーターシーケンスのそれぞれが最適なプロモーター活性に必要であり、それが必要であり、それらは、HFR-KB遺伝子のこのP4プロモーターで協力的に相互作用します。

The human folate receptors (hFRs) are important in the cellular accumulation of folates and antifolates. We described the structure of the human KB cell FR (hFR-KB) gene and identified two discrete promoter regions (P1 and P4) upstream from exons 1 and 4, respectively (Elwood et al., 1993). To further understand the molecular basis of hFR expression, we have now analyzed the basal transcription of the P4 promoter localized upstream of a major transcription start site. The sequence upstream from exon 4 contains several potential transcriptional factor-binding sites and a consensus initiator region sequence at the transcription start site but does not contain canonical TATA or CAAT boxes. While deletion of a 5' flanking sequence from nt -1023 to nt -605 of P4 promoter region decreases the luciferase reporter gene expression in KB cells to 54-70% of control construct, the removal of the sequence between nt -292 and nt -46 markedly decreases the activity to 3%. DNase I footprints and competitive mobility shift and supershift mobility assays indicate that Sp1 or Sp1-related nuclear protein(s) bind to three clustered GC-rich regions within the sequence between nt -292 and nt -46 of the hFR-KB P4 promoter. Both in vitro and in vivo analyses of the expression of promoter constructs containing site-specific mutation(s) of these three Sp1-binding sites and initiator sequence demonstrate that each of three Sp1 sites and the initiator sequence are required for optimum promoter activity and that they interact cooperatively in this P4 promoter of the hFR-KB gene.