内皮細胞における細胞外ATP分解の阻害

ヒト臍静脈内皮細胞株（ECV304）の原形質膜ATPaseは、外部酵素であることが実証されました。ATPの加水分解は、無機リンの出現を監視することにより測定されました。細胞外ATPの加水分解は、オリゴマイシン、バナジン酸、ウアベイン、およびN-エチルマレイミドに鈍感であり、細胞内イオンポンプアットパゼを阻害する化合物です。ベータ - グリセロリン酸（1〜10 mM）またはp-ニトロフェニルリン酸（1〜10 mM）は、ATPの加水分解を阻害せず、非特異的ホスファターゼの関与を除外しました。以前に細胞とインキュベートされていた緩衝液中の酵素活性は7％未満であり、測定された酵素活性は細胞内酵素の放出に起因しなかったことを示しています。これと一致して、使用された細胞調製物は、サイトゾル酵素乳酸デヒドロゲナーゼの放出によって判断されるように、95％を超えていると推定されました。酵素活性はCa2-/Mg2依存性でした。グラミシジンS（20ミクロム）、スラミン（100-300ミクロム）、クロルプロマジン（250ミクロム）、トリフルオペラジン（50-250ミクロム）、およびチオリダジン（100ミクロム）は、ATP（3 mm）の加水分解を45-80％阻害しました。これらの物質によって生成される割合の阻害は、アルファの濃度、ベータメチレンADP（10マイクローム）の存在下では変化しませんでした。またはecto-adpase。心臓を含むさまざまな組織から放出されるATPの絶対量の測定は、ATPがアデノシンに迅速かつ連続的に加水分解されているため妨げられています。ATP分解を阻害する化合物の同定は、この問題を克服するのに役立ち、プリン研究の他の多くの側面において貴重な薬理学的ツールの開発につながるでしょう。

The plasma membrane ATPase on the human umbilical vein endothelial cell line (ECV304) was demonstrated to be an ecto-enzyme. Hydrolysis of ATP was measured by monitoring the appearance of inorganic phosphorus. Hydrolysis of extracellular ATP was insensitive to oligomycin, vanadate, ouabain and N-ethylmaleimide, compounds that inhibit the intracellular ion pumping ATPases. Beta-Glycerophosphate (1-10 mM) or p-nitrophenyl phosphate (1-10 mM) did not inhibit hydrolysis of ATP, ruling out the involvement of non-specific phosphatases. Enzyme activity in buffer that had previously been incubated with cells was < 7%, showing that the enzyme activity measured did not result from release of intracellular enzymes. Consistent with this, the cell preparations used were estimated to be > 95% intact as judged by release of cytosolic enzyme lactate dehydrogenase. The enzyme activity was Ca2-/Mg2- dependent. Gramicidin S (20 microM), suramin (100-300 microM), chlorpromazine (250 microM), trifluoperazine (50-250 microM), and thioridazine (100 microM) inhibited the hydrolysis of ATP (3 mM) by 45-80%. The percentage inhibition produced by these substances was not altered in the presence of a concentration of alpha, beta-methylene ADP (10 microM) which inhibited hydrolysis of AMP (3 mM) by 90%, suggesting that these compounds inhibit ecto-ATPase and/or ecto-ADPase. Measurements of absolute amounts of ATP released from various tissues, including the heart, have been hindered because ATP is rapidly and sequentially hydrolysed to adenosine. Identification of compounds that inhibit ATP degradation would prove to be useful to overcome this problem and would lead to the development of invaluable pharmacological tools in many other aspects of purine research.