分裂酵母Schizosaccharomyces Pombeからの低分子量タンパク質チロシンホスファターゼ、STP1の精製と特性評価

分裂酵母の遺伝的スクリーニングは、Cdc25-22を救助するStp1+という名前の遺伝子を特定しました[Mondesert et al。（1994）J。Biol。化学。269、27996-27999]。この遺伝子は、哺乳類種にのみ存在することが知られていた低分子量タンパク質チロシンホスファターゼ（低M（R）PTPase）のメンバーと42％同一の17.4 kDaタンパク質をコードします。運動学および構造研究に適した大量の均一な組換え酵母低M（R）PTPase、STP1を得るために、シンプルで効率的な精製手順が開発されました。Authentic STP1は、アミノ末端タンパク質シーケンスとエレクトロスプレーイオン化質量分析分析によって判断されるように生成されました。STP1は、リン酸アリール（ホスホチロシンなど）とリン酸アルキル（ホスホセリンなど）の両方に向けて固有のホスファターゼ活性を有することが示されました。STP1はまた、ホスホチロシルペプチド/タンパク質基質を脱リン酸化しました。酵母酵素は哺乳類の酵素よりも6倍遅かったため、30度CおよびpH 6.0での前測定状態の停止フロー分光運動分析を受けやすくなりました。バースト速度は、P-ニトロフェニルリン酸を基質として使用してSTP1で観察され、速度制限ステップがホスホ酵素中間体の分解に対応することを示唆しています。興味深いことに、ウシ心臓低M（R）PTPaseは、同等の効率でホスホチロシルとホスホセリル/スレオニルタンパク質基質の両方からリン酸基を除去することができました。ホスファターゼのCDC25ファミリーと同様に、低M（R）PTPaseは、細胞周期制御に関与する可能性のあるデュアル特異性ホスファターゼの新しいグループを表している可能性があります。

Genetic screening in fission yeast has identified a gene named stp1+ that rescues cdc25-22 [Mondesert et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 27996-27999]. This gene encodes a 17.4 kDa protein that is 42% identical to members of the low molecular weight protein tyrosine phosphatases (low M(r)PTPases) previously known to exist only in mammalian species. A simple and efficient purification procedure was developed to obtain the homogeneous recombinant yeast low M(r)PTPase, Stp1, in large quantities suitable for kinetic and structural studies. Authentic Stp1 was produced as judged by amino terminal protein sequencing and electrospray ionization mass spectrometry analyses. Stp1 was shown to possess intrinsic phosphatase activity toward both aryl phosphates (such as phosphotyrosine) and alkyl phosphates (such as phosphoserine). Stp1 also dephosphorylated phosphotyrosyl peptide/protein substrates. The yeast enzyme was 6-fold slower than the mammalian enzymes, which made it amenable to pre-steady-state stopped-flow spectroscopic kinetic analysis at 30 degrees C and pH 6.0. Burst kinetics was observed with Stp1 using p-nitrophenyl phosphate as a substrate, suggesting that the rate-limiting step corresponds to the decomposition of the phosphoenzyme intermediate. Interestingly, the bovine heart low M(r)PTPase was capable of removing phosphate groups from both phosphotyrosyl and phosphoseryl/threonyl protein substrates with comparable efficiencies. The low M(r)PTPases, like the Cdc25 family of phosphatases, may represent a new group of dual specificity phosphatases which may be involved in cell cycle control.