肝細胞における細胞質pHの調節における液胞アデノシントリホスファターゼの役割

液胞アデノシントリホスファターゼ（V-ATPase）およびNa/H交換の活性に影響を与える薬剤に対する懸濁液中の肝細胞の細胞質pHの応答が研究されています。サイトゾルpHの変化は、2 '、7'-Bis-（2-カルボキシエチル）-5（および6）-CarboxyFluoresceinの蛍光の二重波長励起（500/440 nm）と14C-の分布から決定されました。ジメチルキサゾリジンジオン;どちらの方法も非常によく似た結果をもたらしました。小胞pHの変化は、エンドサイトーシスによって採取されたフルオレセインイソチオシアン酸 - デキストランとローダミンBイソチオシアン酸デキストランの蛍光を比較することにより決定されました。分離されたオルガネラのV-ATPaseを阻害する硝酸塩は、細胞ゾルの濃度依存性酸性化と小胞のアルカリ化を誘導し、それぞれの場合に25-37.5 mmで最大効果があり、V-ATPaseがサイトゾルプロトンの除去に寄与することを示しています。硝酸塩への継続的な暴露時に、酸性化はアミロライド抑制性の逆転を受けました。NO3-の高濃度では、サイトゾル酸性化と小胞アルカリ酸塩の両方が減少または存在しませんでした。Bafilomycin A1は小胞pH​​のアルカリン化を引き起こしました。おそらく他のイオン交換のために、サイトゾル酸性化は観察されませんでした。酸性負荷からのサイトゾルpHの回復（5％CO2への2分の暴露）は、25 mM NO3-およびウアベインの両方に敏感でした。硝酸効果のpH依存性は、異なるpHの培地でテストされました。この活性は細胞質pH 6.2で無視でき、サイトゾルpH 7.3で最大に上昇しました。0.5-1.0 mMウアベインで肝細胞を処理すると、サイトゾルの初期アルカリ酸塩（0.5〜2分間）が生じ、その後自発的な反転が続き、時にはさらなる酸性化が行われました。アルカリ化は25 mM No3-によってブロックされましたが、グルコン酸25 mmではありませんでした。結果は、サイトゾルアルカリ化がV-ATPase活性によるH+取り込みの刺激によって引き起こされることを示唆しています。V-ATPaseは、肝細胞のサイトゾルpHの調節に重要な貢献をしていると結論付けています。

The responses of the cytosolic pH of hepatocytes in suspension to agents affecting the activity of vacuolar adenosine triphosphatase (V-ATPase) and Na/H exchange have been studied. Changes of cytosolic pH were determined both with dual-wavelength excitation (500/440 nm) of the fluorescence of 2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5(and 6)-carboxyfluorescein and from the distribution of 14C-dimethyloxazolidinedione; both methods gave very similar results. Changes of vesicular pH were determined by comparing the fluorescence of fluorescein isothiocyanate-dextran and rhodamine B isothiocyanate-dextran taken up by endocytosis. Nitrate, which inhibits V-ATPase in isolated organelles, induced a concentration-dependent acidification of the cytosol and alkalinization of vesicles, with maximal effects at 25-37.5 mM in each case, indicating that V-ATPase contributes to removal of cytosolic protons. On continued exposure to nitrate, the acidification underwent an amiloride-inhibitable reversal. At the higher concentrations of NO3-, both cytosolic acidification and vesicular alkalinization were reduced or absent. Bafilomycin A1 caused alkalinization of vesicular pH; cytosolic acidification was not observed, possibly because of other ionic exchanges. Recovery of cytosolic pH from an acid load (2 min exposure to 5% CO2) was sensitive to both 25 mM NO3- and to ouabain. The pH dependence of the nitrate effect was tested with media of different pH; the activity was negligible at cytosolic pH 6.2 and rose to a maximum at cytosolic pH 7.3. Treatment of hepatocytes with 0.5-1.0 mM ouabain resulted in an initial alkalinization (0.5-2 min duration) of the cytosol, followed by a spontaneous reversal and, on occasion, further acidification. The alkalinization was blocked by 25 mM NO3-, but not by 25 mM gluconate. The results suggest that the cytosolic alkalinization is caused by a stimulation of H+ uptake by V-ATPase activity. We conclude that V-ATPase make an important contribution to the regulation of the cytosolic pH of hepatocytes.