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フローサイトメトリーは、食品や飲み物の微生物の検出に使用できる迅速で敏感な方法です。この方法の重要な要件は、標的細胞の十分な蛍光染色です。フルオレセインジアセテート（FDA）および5-（および6-）カルボキシフルオレセインジアセテート（CFDA）による酵母サッカロミセスセレビシアの染色メカニズムを詳細に研究しました。プレフルオロクロムの取り込み率は、濃度に直接比例して増加し、飽和していませんでした。これは、パッシブ拡散プロセスを介して輸送が発生することを示唆しています。CFDAの透磁率係数は1.3 x 10（-8）m S-1でした。細胞内に入ると、エステルは細胞内エステラーゼとその蛍光生成物によって加水分解されました。細胞抽出物のFDA加水分解（40度C）は、1次反応速度論によって記述され、0.33 S-1の速度定数（k）が計算されました。細胞抽出物におけるCFDAの加水分解（40度C）は、それぞれタンパク質-1と0.29 mmの12.3 nmol.min-1.mgの見かけのVmaxとkmを伴うMichaelis-Menten速度論によって記述されました。FDAの輸送は加水分解速度よりも速いため、フルオレセインの蓄積はエステラーゼ活性によって制限される可能性が最も高い。対照的に、カルボキシフルオレセインの蓄積は、セルエンベロープを介したCFDAのはるかに遅い輸送によって制限されていました。蛍光染色を記述するために、単純な数学モデルが開発されました。FDAおよびCFDAによる酵母細胞の最適染色への影響について説明します。
フローサイトメトリーは、食品や飲み物の微生物の検出に使用できる迅速で敏感な方法です。この方法の重要な要件は、標的細胞の十分な蛍光染色です。フルオレセインジアセテート（FDA）および5-（および6-）カルボキシフルオレセインジアセテート（CFDA）による酵母サッカロミセスセレビシアの染色メカニズムを詳細に研究しました。プレフルオロクロムの取り込み率は、濃度に直接比例して増加し、飽和していませんでした。これは、パッシブ拡散プロセスを介して輸送が発生することを示唆しています。CFDAの透磁率係数は1.3 x 10（-8）m S-1でした。細胞内に入ると、エステルは細胞内エステラーゼとその蛍光生成物によって加水分解されました。細胞抽出物のFDA加水分解（40度C）は、1次反応速度論によって記述され、0.33 S-1の速度定数（k）が計算されました。細胞抽出物におけるCFDAの加水分解（40度C）は、それぞれタンパク質-1と0.29 mmの12.3 nmol.min-1.mgの見かけのVmaxとkmを伴うMichaelis-Menten速度論によって記述されました。FDAの輸送は加水分解速度よりも速いため、フルオレセインの蓄積はエステラーゼ活性によって制限される可能性が最も高い。対照的に、カルボキシフルオレセインの蓄積は、セルエンベロープを介したCFDAのはるかに遅い輸送によって制限されていました。蛍光染色を記述するために、単純な数学モデルが開発されました。FDAおよびCFDAによる酵母細胞の最適染色への影響について説明します。
Flow cytometry is a rapid and sensitive method which may be used for the detection of microorganisms in foods and drinks. A key requirement for this method is a sufficient fluorescence staining of the target cells. The mechanism of staining of the yeast Saccharomyces cerevisiae by fluorescein diacetate (FDA) and 5- (and 6-)carboxyfluorescein diacetate (cFDA) was studied in detail. The uptake rate of the prefluorochromes increased in direct proportion to the concentration and was not saturable, which suggests that transport occurs via a passive diffusion process. The permeability coefficient for cFDA was 1.3 x 10(-8) m s-1. Once inside the cell, the esters were hydrolyzed by intracellular esterases and their fluorescent products accumulated. FDA hydrolysis (at 40 degrees C) in cell extracts could be described by first-order reaction kinetics, and a rate constant (K) of 0.33 s-1 was calculated. Hydrolysis of cFDA (at 40 degrees C) in cell extracts was described by Michaelis-Menten kinetics with an apparent Vmax and Km of 12.3 nmol.min-1.mg of protein-1 and 0.29 mM, respectively. Accumulation of fluorescein was most likely limited by the esterase activity, since transport of FDA was faster than the hydrolysis rate. In contrast, accumulation of carboxyfluorescein was limited by the much slower transport of cFDA through the cell envelope. A simple mathematical model was developed to describe the fluorescence staining. The implications for optimal staining of yeast cells with FDA and cFDA are discussed.
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