TRAXの特性評価、F-ピリンサブユニットのアセチル化に必要なFプラスミド遺伝子座

F-Pilinサブユニットのアセチル化は、以前にFプラスミド移動オペロン遺伝子TRAXの発現に依存することが示されています。Fの共役移動におけるピリンアセチル化の要件を評価するために、TRAX :: KAN挿入変異を構築し、それらを伝染性F誘導体POX38に交差させました。標準条件下では、TRAXの機能は不可欠であると思われました。変異体プラスミドPox38-Trax482およびPox38-Trax483によって合成されたピリンはアセチル化されていませんでしたが、F-Pilus産生およびF-Pilus特異的ファージ感染症は正常であると思われ、野生型頻度で転写が発生しました。標識産物の分析により、Trax+プラスミドは、細胞の細胞質膜に局在する2つの約24-（Trax1）と22-kDa（Trax2）ポリペプチドを発現することが示されました。TRAXオープンリーディングフレーム（27.5 kDa）から予測された製品とサイズが類似した製品は検出されませんでした。したがって、部位指向の突然変異誘発、停止コドンリンカー挿入、およびPHOA融合分析を使用して、TRAX発現を調査しました。Trax1とTrax2の両方が、TRAXオープンリーディングフレームによってエンコードされているように見えました。TRAX C末端コーディング領域への停止コドンリンカーの挿入により、2つの対応する切り捨てられた生成物が合成され、PHOAへの融合は、TRAXリーディングフレームのみが翻訳されたことを示しました。表現は、Trax M1 Start Codonにも非常に依存していました。これが変更されたとき、タンパク質産物は観察されませんでした。ただし、ピリンアセチル化活性は依然として検出可能であり、他のいくつかのフレーム開始コドンも使用できることを示しています。アクティビティに不可欠なすべての配列は、TRAXコドン29と225の間に含まれています。シーケンス分析は、TRAX mRNAがさまざまな基本ペアの構造を形成できることを示しました。TRAX発現は翻訳的に制御され、F-Pilinアセチル化活性は細胞の生理学的条件によって調節される可能性があることを示唆しています。

Acetylation of F-pilin subunits has previously been shown to depend upon expression of the F plasmid transfer operon gene traX. To assess the requirement for pilin acetylation in conjugative transfer of F, we constructed traX::kan insertion mutations and crossed them onto the transmissible F derivative pOX38. Under standard conditions, the function of traX seemed to be dispensable. Although pilin synthesized by mutant plasmids pOX38-traX482 and pOX38-traX483 was not acetylated, F-pilus production and F-pilus-specific phage infection appeared to be normal and transfer occurred at wild-type frequency. Analysis of labeled products showed that TraX+ plasmids expressed two approximately 24- (TraX1) and 22-kDa (TraX2) polypeptides that localized in the cytoplasmic membranes of cells. No product that was similar in size to the product predicted from the traX open reading frame (27.5 kDa) was detected. Therefore, we used site-directed mutagenesis, stop codon linker insertions, and phoA fusion analysis to investigate traX expression. Both TraX1 and TraX2 appeared to be encoded by the traX open reading frame. Insertion of a stop codon linker into the traX C-terminal coding region led to synthesis of two correspondingly truncated products, and fusions to phoA indicated that only the traX reading frame was translated. Expression was also very dependent on the traX M1 start codon; when this was altered, no protein products were observed. However, pilin acetylation activity was still detectable, indicating that some other in-frame start codon(s) can also be used. All sequences that are essential for activity are contained between traX codons 29 and 225. Sequence analysis indicated that traX mRNA is capable of forming a variety of base-paired structures. We suggest that traX expression is translationally controlled and that F-pilin acetylation activity may be regulated by physiological conditions in cells.