LIAC/SS-DNA/PEG手順による無傷の酵母細胞の変換に関する研究

酢酸リチウム（LIAC）/一本鎖DNA（SS-DNA）/ポリエチレングリコール（PEG）プロトコルが> 1 x 10（6）形質因子/マイクログラムプラスミドDNAと、Schiestl and Gietz（1989）によって記述された元のプロトコルを生成する改善された改善LIAC/SS-DNA/PEG変換のメカニズムの側面を調査するために使用されました。50マイクログラムSSキャリアDNAの存在下で1 x 10（8）細胞を100 ngプラスミドDNAで形質転換した場合、最高の形質転換効率が観察されました。形質転換体の収率は、変換ごとに最大5マイクログラムプラスミドまで直線的に増加しました。最大収量には、42度Cで20分間の熱ショックが必要でした。PEGは、キャリアDNAとプラスミドDNAの両方を細胞に堆積させることがわかった。SSキャリアDNAは、細胞により効果的に結合し、二本鎖（DS）キャリアよりも32p標識プラスミドDNAの緊密な結合を引き起こしました。LIAC/SS-DNA/PEG変換法は、細胞融合をもたらしませんでした。DSキャリアDNAは、形質転換反応でDSベクターDNAと競合しました。SSプラスミドDNAは、SSおよびDSキャリアDNAの両方と組み合わせて細胞を不十分に形質転換しました。LIAC/SS-DNA/PEG法は、細胞を変換できるようにすることが知られている他の治療よりも効果的であることが示されました。LIAC/SS-DNA/PEGメソッドによる変換のメカニズムのモデルについて説明します。

An improved lithium acetate (LiAc)/single-stranded DNA (SS-DNA)/polyethylene glycol (PEG) protocol which yields > 1 x 10(6) transformants/micrograms plasmid DNA and the original protocol described by Schiestl and Gietz (1989) were used to investigate aspects of the mechanism of LiAc/SS-DNA/PEG transformation. The highest transformation efficiency was observed when 1 x 10(8) cells were transformed with 100 ng plasmid DNA in the presence of 50 micrograms SS carrier DNA. The yield of transformants increased linearly up to 5 micrograms plasmid per transformation. A 20-min heat shock at 42 degrees C was necessary for maximal yields. PEG was found to deposit both carrier DNA and plasmid DNA onto cells. SS carrier DNA bound more effectively to the cells and caused tighter binding of 32P-labelled plasmid DNA than did double-stranded (DS) carrier. The LiAc/SS-DNA/PEG transformation method did not result in cell fusion. DS carrier DNA competed with DS vector DNA in the transformation reaction. SS plasmid DNA transformed cells poorly in combination with both SS and DS carrier DNA. The LiAc/SS-DNA/PEG method was shown to be more effective than other treatments known to make cells transformable. A model for the mechanism of transformation by the LiAc/SS-DNA/PEG method is discussed.