骨芽細胞における副甲状腺ホルモンに対する環状AMP応答の単一細胞分析

以前に、PTHに対する[Ca2+] I応答は、単一のUMR-106-01骨形成肉腫細胞では不均一であることを実証しました。応答の不均一性がPTHシグナル伝達の普遍的な特徴であるかどうかを検証するために、cAMPに敏感な蛍光指標FLCRHRを使用して、UMR-106-01細胞およびヒト骨骨骨骨芽細胞（HOB）の単層培養でcAMPの生産が監視されました。FLCRHRは単一のセルにマイクロインジェクションされ、500-530/> 560 nm蛍光比は、cAMP濃度の尺度として共焦点レーザーキャンニングビデオイメージングによって監視されました（[CAMP]）。ウシPTH（1-34）（10（-7）m）に曝露した実質的にすべてのUMR-106-01細胞は、細胞内[cAMP]の増加を示し、平均蛍光比はベースラインの145 +/- 17％の変化（n = 15）を示し、[n = 15）。30分。この効果には、細胞質から核へのプロテインキナーゼAのフルオレセイン標識触媒サブユニットのゆっくりとした転座が伴いました。対照的に、PTH（1-34）はHOB細胞の[cAMP]の検出可能な増加を引き起こしませんでしたが、PGE2（3 x 10（-6）m）刺激はFLCRHR比を増加させることができました（154 +/- 27％、n = 10）。切り捨てられたフラグメントPTH（2-34）は、PTH（1-34）では67％しか強力でしたが、N末端での最初の2つのアミノ酸の欠失は、UMR-106-01細胞でのcAMP産生を刺激するホルモンの能力を廃止しました。PTH（3-34）またはPTH（7-34）のいずれかの10（-7）mへの短い曝露は、等モル用量のPTH（1-34）によって誘導される蛍光比変化の振幅に影響を与えませんでした。したがって、PTHで刺激された骨芽細胞様細胞では、[cAMP]応答は、[ca2+] i応答よりも細胞から細胞へとはるかに均質です。

We previously demonstrated that the [Ca2+]i response to PTH is heterogeneous in single UMR-106-01 osteogenic sarcoma cells. To verify whether response heterogeneity is a universal feature of PTH signal transduction, cAMP production was monitored in monolayer cultures of UMR-106-01 cells and human trabecular bone osteoblasts (HOB) using the cAMP-sensitive fluorescent indicator FlCRhR. FlCRhR was microinjected into single cells, and the 500-530/> 560 nm fluorescence ratio was monitored by confocal laserscanning video imaging as a measure of cAMP concentration ([cAMP]). Virtually all UMR-106-01 cells exposed to bovine PTH(1-34) (10(-7) M) exhibited an increase in intracellular [cAMP], with an average fluorescence ratio change of 145 +/- 17% of baseline (n = 15), corresponding to nearly maximal dissociation of protein kinase A. In the continued presence of the hormone (10(-7) M), [cAMP] remained elevated for at least 30 minutes. This effect was accompanied by a slow translocation of the fluorescein-labeled catalytic subunit of protein kinase A from the cytoplasm to the nucleus. In contrast, PTH(1-34) caused no detectable increase in [cAMP] in HOB cells, although PGE2 (3 x 10(-6) M) stimulation was able to increase the FlCRhR ratio (154 +/- 27%, n = 10). The truncated fragment PTH(2-34) was only 67% as potent at PTH(1-34), but deletion of the first two amino acids at the N terminus abolished the hormone's ability to stimulate cAMP production in UMR-106-01 cells. Brief exposure to 10(-7) M of either PTH(3-34) or PTH(7-34) did not affect the amplitude of the fluorescence ratio change induced by equimolar doses of PTH(1-34). Thus, in osteoblast-like cells stimulated with PTH, the [cAMP] response is much more homogeneous from cell to cell than the [Ca2+]i response.