LelyStadウイルスのORFS 2から7によってコードされたタンパク質の特性評価

陽性鎖RNAウイルスであるLelyStadウイルス（LV）のゲノムは、長さ15 kbで、推定ウイルスタンパク質をコードする8つのオープンリーディングフレーム（ORF）が含まれています。ORF 2から7は、SP6 RNAポリメラーゼプロモーターの下流のプラスミドでクローン化され、in vitroで生成された転写産物の翻訳は、ブタ抗LV血清で免疫沈降する可能性のあるタンパク質を生成しました。15〜17アミノ酸の合成ポリペプチドをORF 2〜7のアミノ酸配列から選択し、アンチペプチド血清をウサギで育てました。ORF 2〜5および7のin vitro翻訳産物を免疫沈降させた抗血清が得られました。ORF 3から7のペプチドに向けられた血清を含む血清は、免疫ペルオキシダーゼ単層アッセイのLV感染肺胞肺マクロファージと陽性に反応しました。これらのアンチペプチド血清およびブタ抗LV血清を使用して、3つの構造タンパク質を特定し、対応する遺伝子を割り当てました。ビリオンには、15 kDa（N）のヌクレオカプシドタンパク質、18 kDa（M）の非グリコシル化膜タンパク質、および25 kDa（E）のグリコシル化膜タンパク質が含まれていることがわかりました。Nタンパク質はORF7によってエンコードされ、Mタンパク質はORF6によってエンコードされ、Eタンパク質はORF5によってコードされます。ウイルス粒子のEタンパク質には、エンドベタn-アセチル-D-グルコサミニダーゼHに耐性のある1つまたは2つのNグリカンが含まれています。この発見は、高マンノースグリカンがゴルジコンパートメントの複雑なグリカンに加工されていることを示しています。LVビリオンのタンパク質組成はさらに、LVが馬動脈炎ウイルス、Symian出血熱ウイルス、および乳酸脱水素エレビティングウイルスに進化的に関連していることを確認します。

The genome of Lelystad virus (LV), a positive-strand RNA virus, is 15 kb in length and contains 8 open reading frames (ORFs) that encode putative viral proteins. ORFs 2 to 7 were cloned in plasmids downstream of the Sp6 RNA polymerase promoter, and the translation of transcripts generated in vitro yielded proteins that could be immunoprecipitated with porcine anti-LV serum. Synthetic polypeptides of 15 to 17 amino acids were selected from the amino acid sequences of ORFs 2 to 7 and antipeptide sera were raised in rabbits. Antisera that immunoprecipitated the in vitro translation products of ORFs 2 to 5 and 7 were obtained. Sera containing antibodies directed against peptides from ORFs 3 to 7 reacted positively with LV-infected alveolar lung macrophages in the immunoperoxidase monolayer assay. Using these antipeptide sera and porcine anti-LV serum, we identified three structural proteins and assigned their corresponding genes. Virions were found to contain a nucleocapsid protein of 15 kDa (N), an unglycosylated membrane protein of 18 kDa (M), and a glycosylated membrane protein of 25 kDa (E). The N protein is encoded by ORF7, the M protein is encoded by ORF6, and the E protein is encoded by ORF5. The E protein in virus particles contains one or two N-glycans that are resistant to endo-beta-N-acetyl-D-glucosaminidase H. This finding indicates that the high-mannose glycans are processed into complex glycans in the Golgi compartment. The protein composition of the LV virions further confirms that LV is evolutionarily related to equine arteritis virus, simian hemorrhagic fever virus, and lactate dehydrogenase-elevating virus.