HL-60顆粒球における低分子量GTP結合タンパク質ARFおよびホスホリパーゼD活性化における50 kDAサイトゾルタンパク質の役割の評価

グアニンヌクレオチドによるホスホリパーゼD（PLD）活性化には、原形質膜とサイトゾルの両方のタンパク質補因子が必要です。HL-60サイトゾルは、硫酸アンモニウムとゲル透過クロマトグラフィーによって分画しました。2つのサイトゾルタンパク質画分が、3Hラベル付きHL-60膜と溶出されたカラム画分で構成される再構成アッセイで、GTPガンマS（グアノシン5'-3-O-（Thio）三リン酸）を再構成することがわかりました。再構成活動の主要なピークは50 kDaの領域にあり、18 kDaの領域でPLD再構成活性の2番目の離散ピークが観察されました。Rho GDP/GTP交換阻害剤、Rho GDIは、RAC2とRhoAと共感染しましたが、RAC1ではなく。RhoaとRac2はRho GDIで完全に複合化され、ゲルろ過クロマトグラフィーにより43 kDaの見かけの分子量で溶出しました。50 kDaの再構成活性のピークとのサイトゾルRAC2とRhoAの間の部分的な重複は、グアニンヌクレオチドによるPLDの活性化におけるサイトゾルRho関連GTPaseの関与と一致していませんでした。しかし、小型GTP結合タンパク質のRhoファミリーのヌクレオチド交換を阻害する組換えRho GDIは、HL-60ホモジネートのGTPガンマS刺激PLD活性を減少させました。RhoおよびRACで活性な刺激交換因子であるSMG GDSは、ゲル透過クロマトグラフィーによってPLD刺激因子から部分的に分離される可能性があります。さらに、組換えSMG GDSはGTP依存性PLD活性を刺激できませんでした。サイトゾルADPリボシル化因子（ARF）は、再構成活性の18 kDaピークにのみ位置していました。モノクローナル抗体1D9を使用して、かすかな量の膜結合ARFも検出されました。塩吸収PLD活性に対する50 kDaおよび18 kDa PLD誘導因子の効果は相乗的でした。ARF単独の弱い刺激効果は、GTPガンマS刺激PLD活性が別のタンパク質、おそらくARF調節タンパク質の存在に依存していることを示唆しました。膜結合GTP結合タンパク質、おそらくARFは、50 kDA画分の成分と組み合わせるとPLDの活性化に関与する可能性があることを提案します。

Phospholipase D (PLD) activation by guanine nucleotides requires protein cofactors in both the plasma membrane and the cytosol. HL-60 cytosol was fractionated by ammonium sulfate and gel-permeation chromatography. Two cytosolic protein fractions were found to reconstitute the GTP gamma S (guanosine 5'-3-O-(thio)triphosphate)-stimulated PLD in a reconstitution assay consisting of 3H-labeled HL-60 membranes and eluted column fractions. The major peak of reconstituting activity was in the region of 50 kDa, and a second discrete peak of PLD reconstitution activity was observed in the region of 18 kDa. Rho GDP/GTP exchange inhibitor, Rho GDI, comigrated with Rac2 and RhoA, but not Rac1. RhoA and Rac2 were entirely complexed with Rho GDI and eluted with an apparent molecular mass of 43 kDa by gel filtration chromatography. The partial overlap between cytosolic Rac2 and RhoA with the 50-kDa peak of reconstituting activity was not consistent with the participation of cytosolic Rho-related GTPases in the activation of PLD by guanine nucleotides. However, recombinant Rho GDI, which inhibits nucleotide exchange on the Rho family of small GTP-binding proteins, reduced GTP gamma S-stimulated PLD activity in HL-60 homogenates. The stimulatory exchange factor, Smg GDS, which is active on Rho and Rac, could be partially separated from the PLD-stimulating factor(s) by gel-permeation chromatography. Moreover, recombinant Smg GDS failed to stimulate GTP-dependent PLD activity. Cytosolic ADP-ribosylation factor (ARF) was exclusively located in the 18-kDa peak of reconstitution activity. Faint amounts of membrane-bound ARF were also detected using the monoclonal antibody 1D9. The effects of the 50-kDa and 18-kDa PLD-inducing factors on the salt-extracted PLD activity were synergistic. The weak stimulatory effect of ARF alone suggested that the GTP gamma S-stimulated PLD activity is dependent on the presence of another protein(s), presumably ARF-regulatory proteins. We propose that a membrane-bound GTP-binding protein, possibly ARF, may be involved in the activation of PLD when combined with the component(s) of the 50-kDa fraction.